復(fù)合真菌多糖體外抗氧化活性研究

王晴 曹穩(wěn)根 錢玉梅 李紅俠 翟科峰 陳紅玲

摘 要：以黑木耳、銀耳、香菇為材料，采用超聲波輔助水提法制備三種真菌多糖，并按等體積比制備復(fù)合真菌多糖，通過比較對DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用，考察復(fù)合真菌多糖與單一真菌多糖抗氧化活性強弱.結(jié)果表明：復(fù)合真菌多糖對DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基清除作用高于黑木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖，呈現(xiàn)協(xié)同作用，為真菌多糖的高效利用及復(fù)合真菌多糖的進一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù).

關(guān)鍵詞：多糖;復(fù)合;真菌;抗氧化

中圖分類號：S646? 文獻標(biāo)識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）01-0063-03

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體或其發(fā)酵液中提取得到，主鏈由β-D型葡萄糖基連接而成，人體必不可少的一種高分子活性聚合物[1].目前國內(nèi)外研究表明，真菌多糖可發(fā)揮多種功能：改變細胞膜成分、影響細胞信號傳遞、誘導(dǎo)細胞凋亡和分化等來抵御、預(yù)防腫瘤威脅，發(fā)揮抗腫瘤作用[2];激活巨噬細胞、活化淋巴細胞以及加強某些細胞因子等，提高機體免疫力[3];與自由基結(jié)合、形成抑制物阻止氧化、促進抗氧化酶生成以及提高抗氧化酶活性，具有抗氧化能力等[4].真菌多糖的相關(guān)研究正在火熱進行，從真菌多糖的生理學(xué)功能、應(yīng)用領(lǐng)域到如何合理制備來提高其生理活性，其中關(guān)于復(fù)合真菌多糖的優(yōu)異性已經(jīng)受到各界學(xué)者的重視.于沖等人[5]將五種不同的真菌多糖按不同比例復(fù)合后，通過測定兩種抗氧化指標(biāo)，結(jié)果表明復(fù)合后的真菌多糖清除自由基的效果更佳，基本呈現(xiàn)協(xié)同增長，由此可見復(fù)合真菌多糖具有較好的開發(fā)及應(yīng)用前景.

以黑木耳、銀耳、香菇為原料，采用超聲輔助水提法制備三種真菌多糖，按等體積比混合得到復(fù)合真菌多糖，通過比較對DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用，考察復(fù)合真菌多糖與單一真菌多糖抗氧化活性強弱，為復(fù)合真菌多糖進一步研究和應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗材料木耳、銀耳、香菇均為市售;試驗試劑葡萄糖、苯酚、水楊酸、焦性沒食子酸、硫酸均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;DPPH購于上海源葉生物科技有限公司;ABTS購于合肥巴斯夫生物科技有限公司;其他試劑均為分析純.

1.2 試驗儀器

DHG-9030A型鼓風(fēng)干燥箱（上海精密儀器儀表有限公司）;XL-04B中草藥粉碎機（廣州旭眾食品機械有限公司）;JY96-IIN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）;R-1001LN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工有限公司）;SC-3612低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）等.

1.3 試驗方法

1.3.1 真菌預(yù)處理

分別將木耳、銀耳、香菇洗凈、剪碎，置于50℃干燥箱中干燥6h，粉碎，過80目篩，按料液比1：20（g/mL）加入90%乙醇，浸提過夜，2700g下離心15min，棄上清液并將殘渣自然風(fēng)干后分別得木耳、銀耳、香菇預(yù)處理粉末.

1.3.2 真菌多糖提取

分別取木耳、銀耳和香菇預(yù)處理粉末3g，按料液比1：30（g/mL）加入蒸餾水，在超聲功率580W，超聲時間1h條件下超聲提取，2700g離心15min，取上清，濃縮，抽濾，定容至100mL，分別得木耳、銀耳、香菇多糖提取液[6].

1.3.3 真菌多糖濃度及得率測定

按廖彭瑩等[7]的方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別取木耳、銀耳、香菇多糖提取液稀釋至適宜倍數(shù)，按制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計算得到提取液多糖濃度，并按下式計算銀耳、木耳、香菇多糖得率：

真菌多糖得率（%）=（c×n×V/m）×100

式中c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的稀釋后的真菌多糖濃度，mg/mL;n為真菌多糖提取液稀釋倍數(shù);V為真菌多糖提取液總體積，mL;m為真菌質(zhì)量，g.

1.3.4 復(fù)合真菌多糖的制備及抗氧化能力測定

將木耳、銀耳、香菇多糖提取液按等體積比（1：1：1）混合，搖勻，制備濃度分別為0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的復(fù)合真菌多糖，按王金璽的方法測定復(fù)合真菌多糖及與其相同濃度的木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖對DPPH自由基清除率[8];制備濃度分別為1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL的復(fù)合真菌多糖，按劉丹丹[9]和許女[10]的方法測定復(fù)合真菌多糖及與其相同濃度的木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖對·OH自由基清除率;制備濃度分別為0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的復(fù)合真菌多糖，按段笑影等的方法測定復(fù)合真菌多糖及與其相同濃度的木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖對O2-·自由基清除率[11];制備濃度分別為1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL的復(fù)合真菌多糖，按楊卓等的方法測定復(fù)合真菌多糖及與其相同濃度的木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖對定ABTS+自由基清除率[12].

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌多糖濃度及得率

超聲波是一種高頻率機械波，能夠通過超聲空化作用向受作用體系提供高能量，從而加速真菌多糖的溶出，此外，超聲波的次級效應(yīng)如機械振動、擊碎、擴散、乳化、化學(xué)效應(yīng)等也能加速多糖的擴散、釋放并使之與溶劑充分混合，有利于多糖提取[13].由表1可知，在超聲功率580W，超聲時間1h的條件下，三種真菌多糖得率具有顯著性差異（P<0.05），其中木耳多糖得率最高，銀耳多糖次之，香菇多糖得率最低，可能由于超聲波對不同真菌組織和細胞壁的破壞程度有所差異，對細胞膜穿透能力和多糖被動運輸能力影響不同而造成.

2.2 復(fù)合真菌多糖對DPPH自由基清除作用

DPPH是一種氮中心自由基，對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子具有攻擊作用，從而引發(fā)機體病變[14].由圖1可知，三種真菌多糖對DPPH自由基清除能力從大到小為：銀耳多糖>木耳多糖>香菇多糖，但復(fù)合真菌多糖對DPPH自由基清除能力均高于任意單一多糖，且多糖濃度在0.1～0.5mg/mL時，清除率基本穩(wěn)定在70%以上，隨多糖濃度的升高清除率變化較小.

2.3 復(fù)合真菌多糖對？OH自由基清除作用

羥自由基是由過氧化氫釋放出的氧化能力和毒性較強、較活潑的活性氧自由基，能夠氧化機體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子，造成人體組織中脂質(zhì)的過氧化、核酸的斷裂、多糖和蛋白質(zhì)的分解，從而導(dǎo)致機體受損和基因突變，引起機體衰老和癌變[15].由圖2可知，當(dāng)多糖濃度為1.0mg/mL時，木耳多糖、香菇多糖、銀耳多糖對·OH自由基清除作用較低，清除率分別為23%、21.82%、22.38%，而復(fù)合真菌多糖清除率為48.68%.對·OH自由基清除作用大小為：復(fù)合真菌多糖>香菇多糖>銀耳多糖>木耳多糖.

2.4 復(fù)合真菌多糖對O2-·自由基清除作用

超氧陰離子自由基是生命體代謝過程中產(chǎn)生的一種氧化能力較強的活性氧自由基，在機體中存在壽命最長，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快機體衰老過程，并可誘發(fā)皮膚病變、心血管疾病、癌癥等[16].圖3表明，對O2-·自由基清除作用大小為：復(fù)合真菌多糖>香菇多糖>銀耳多糖>木耳多糖，復(fù)合真菌多糖真高清除為最高達到80.42%.

2.5 復(fù)合真菌多糖對ABTS+自由基清除作用

ABTS在適宜條件下被氧化會生成穩(wěn)定綠色的ABTS+，在734nm下有特征吸收峰，加入抗氧化物質(zhì)會抑制綠色ABTS+自由基的生成，使顏色減弱.對ABTS+的清除能力能反映出抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力[14].圖4表明，在多糖濃度為1.0～2.0mg/mL，復(fù)合真菌多糖對ABTS+清除作用均在90%以上，且高于其他三種單一真菌多糖，當(dāng)多糖濃度為1.2mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL時，復(fù)合真菌多糖對ABTS+清除率清除作用甚至超過Vc.ABTS+自由基清除能力大小為：復(fù)合真菌多糖>香菇多糖>木耳多糖>銀耳多糖.

3 結(jié)論與討論

真菌多糖具有豐富的生物活性，并且無毒副作用，是當(dāng)前最具開發(fā)潛力的功能性食品的新資源[17].自由基是共價鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團，化學(xué)性質(zhì)極活潑，如果體內(nèi)大量自由基存在，會與脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，造成器官、組織和細胞的功能衰退，引起一系列慢性疾病，并且加速衰老[18].大量研究表明，真菌多糖具有清除自由基作用，且不同真菌多糖的復(fù)合，其作用可互補和協(xié)同[19]，因此復(fù)合真菌多糖的抗氧化活性研究，在真菌多糖的開發(fā)與應(yīng)用中具有重要的意義.

利用超聲波輔助水提法制備木耳多糖、香菇多糖、銀耳多糖，并按等體積比制備復(fù)合真菌多糖，通過對DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用的考察，得到復(fù)合真菌多糖對四種自由基清除能力均高于三種單一真菌多糖，呈現(xiàn)出協(xié)同作用，表明復(fù)合真菌多糖的抗氧化作用并非是真菌多糖成分的簡單疊加，各種成分間存在著相輔相成、相互為用的關(guān)系，其相加、協(xié)同或拮抗作用不容忽視，且采用何種方式組合配伍能最大程度提高復(fù)合多糖活性至關(guān)重要，且具有巨大的經(jīng)濟價值，仍需進一步探索.

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