黃芩素-茶堿共晶的溶劑體系篩選及體外溶出度評價*

張 瀛 ，皮佳鑫 ，李 雯 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 301617）

黃芩素（Baicalein，BE，圖 1）是一種具有活性的黃酮類化合物，主要存在于黃芩的干燥根中[1]。BE具有抗氧化、抗自由基、抗癌、抗硬化、抗菌、抗炎以及心肺和神經(jīng)保護等多種藥理作用[2-4]。但是BE在水中溶解度低，溶出速率慢、口服吸收差嚴重限制了它的臨床應(yīng)用。

共晶技術(shù)在改善活性藥物成分的溶解度和溶出度及提高其生物利用度等方面具有良好的應(yīng)用前景[5-6]。共晶是一種結(jié)晶復合物，由兩個及以上成分按照固定的化學計量比，通過非共價鍵連接在一起[7-8]。由于共晶可以在不影響分子結(jié)構(gòu)和生物活性的前提下，改變藥物的溶解度、溶出度、吸濕性、穩(wěn)定性等性質(zhì)，近年來在藥物研發(fā)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[9]。

BE分子中具有3個羥基和1個羧基，容易與嘌呤類[10]、酰胺類[11]等化合物形成共晶。Zhu等[12]制備了BE-咖啡因共晶，結(jié)果顯示BE-咖啡因共晶促進了BE的溶解度和生物利用度，BE-煙酰胺共晶的制備同樣提高了其體外溶出度與口服生物利用度[13-15]。本課題組在前期工作中以BE為活性成分，茶堿（Theophylline，TH，圖 2）為配體，成功制備了BE-TH共晶，對其進行了表征和評價。大鼠體內(nèi)藥代動力學表明BE-TH共晶可以提高BE的口服生物利用度[16]。

圖1 黃芩素的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of baicalein

圖2 茶堿的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structureof theophylline

然而，在BE-TH共晶體系當中，配體TH具有明確藥理活性。TH作為臨床常用藥物，能夠顯著緩解支氣管炎和心臟性呼吸困難等癥狀，且常以緩釋制劑應(yīng)用于臨床，以緩解普通制劑的胃腸黏膜刺激性。另外，TH常被當作活性成分來制備共晶，以改善溶解性[17]，提高穩(wěn)定性[18]。臨床上，由茶堿鈉與甘氨酸制備而成的甘氨酸茶堿鈉，在水中溶解度較好，可以起到改善吸收并減輕胃腸道刺激的作用[19]。因此，在BE-TH共晶體系中，應(yīng)進一步研究BE-TH共晶體系對兩種活性成分各自的影響，并從兩種成分共用的角度思考BE-TH共晶的臨床應(yīng)用潛在價值。

研究旨在以前期工作為基礎(chǔ)，嘗試從二元體系出發(fā)，將BE和TH作為共晶形成物，通過繪制BETH-溶劑體系的三元相圖，對制備BE-TH共晶的溶劑體系進行優(yōu)選。并通過體外溶出實驗，初步考察形成共晶對BE與TH各自溶出度的影響，為共晶二元系統(tǒng)的進一步深入研究提供參考。

1 試藥與儀器

BE（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；TH（純度≥98%，北京百靈威科技有限公司）；BE對照品（含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；TH對照品（含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；丙酮（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津康科德科技有限公司）；甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；甲酸[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；實驗用水為采用Milli-Q水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）制得。

十萬分之一天平（XP205，瑞士Mettler-Toledo公司）；高效液相色譜儀（SPD-10A plus，日本島津公司，包括SPD-20A紫外檢測器、LC-20AT泵、LC Solution色譜工作站）；全自動溶出取樣系統(tǒng)（DT-820，德國ERWEKA公司）；差示掃描量熱儀（Jade DSC，美國Perkin Elmer公司）；透皮擴散試驗儀（TK-20B型，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）。

2 方法

2.1 HPLC分析方法 溶液中BE和TH濃度的測定采用高效液相色譜法。色譜柱為Inertsil ODSC18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為 0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），濃度梯度為 0～3min，B：5%；3～6min，B：5%～80%；6～14 min，B：80%；14～15 min，B：80%～5%；15～18 min，B：5%；流速為 1.0 mL/min；檢測波長為276 nm，柱溫為30℃，進樣量為20μL。

2.2 3種溶劑中BE、TH及BE-TH共晶的飽和溶解度測定 精密量取乙酸乙酯、甲醇和丙酮各2 mL置潔凈的西林瓶中，分別加入過量的BE、TH或BE-TH共晶，密封后置25℃條件下恒溫攪拌24 h使之達到溶解平衡，混懸液經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，以甲醇適度稀釋續(xù)濾液，按照“2.1”項方法測定續(xù)濾液中BE和TH的濃度。所有樣品平行實驗3份。

2.3 相圖的測定 根據(jù)TH在乙酸乙酯、甲醇和丙酮中的溶解度，配制一系列濃度的TH乙酸乙酯、甲醇和丙酮溶液，在其溶解度范圍內(nèi)設(shè)定TH的濃度，分別為 0.4、0.2、0.1、0.05 和 0.025 mg/mL，經(jīng)有機濾膜濾過后，分別加入過量的BE-TH共晶，密封后置于25℃條件下恒溫攪拌24 h，達到溶解平衡后，混懸液經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，以甲醇適度稀釋續(xù)濾液，按照“2.1”項方法測定續(xù)濾液中BE和TH的濃度。所有樣品平行實驗3份。

2.4 BE-TH共晶的制備 BE與TH以摩爾比為1∶1的比例制備共晶。量取一定量的丙酮置于200 mL燒杯中，加入0.36 g的TH，攪拌、超聲至全部溶解，另稱取0.54 g的BE加入50 mL西林瓶中，往此西林瓶中少量加入含TH的丙酮溶液，放入轉(zhuǎn)子于磁力攪拌器上以200 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，至溶劑揮干后，繼續(xù)少量加入上述TH丙酮溶液直至全部揮發(fā)，干燥，得到BE-TH共晶固體。

2.5 體外溶出度的測定

2.5.1 溶出介質(zhì)的配制 人工腸液：精密稱取牛膽酸鈉約9.66 g、氯化鈉約24.02 g、卵磷脂約0.54 g、馬來酸約13.32 g、氫氧化鈉約8.35 g于6 L去離子水中，攪拌至溶解。人工胃液：精密稱取?；悄懰徕c約0.26 g、胃蛋白酶約0.60 g、卵磷脂約 0.055 g、氯化鈉約12.00 g于6 L去離子水中，攪拌至溶解后，以0.1 mol/L鹽酸（HCL）調(diào)節(jié)pH至1.6。

2.5.2 體外溶出度考察 精密稱取BE原料藥約18 mg、TH原料藥約12.82 mg、BE-TH物理混合約30.82 mg、BE-TH共晶約 31.55 mg（折合BE約18 mg）至硬殼膠囊中。溶出介質(zhì)分別為人工腸液和人工胃液。參照《中華人民共和國藥典》溶出度實驗方法，將膠囊置于轉(zhuǎn)籃中，浸沒于溶出介質(zhì)900 mL中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為 100 r/min，控制溫度為（37.0±0.5）℃，于 5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300 和 360min取樣2mL，并立即補充等量等溫溶出介質(zhì)。溶出樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，注入液相色譜儀，按照2.1項下的色譜條件分析計算累積溶出度。

3 結(jié)果與討論

3.1 分析方法的建立 BE峰面積（A）在1～100μg/mL內(nèi)與質(zhì)量濃度（C）呈良好線性關(guān)系（回歸方程為：A=1.08×105C-49 693，R2=0.999 95）；TH 的峰面積（A）在1～100μg/mL內(nèi)與質(zhì)量濃度（C）呈良好線性關(guān)系（回歸方程為：A=6.94×104C+16 486，R2=0.999 82）；BE含量測定的精密度在1%之內(nèi)，TH含量測定的精密度在0.8%以內(nèi)，均符合要求，待測樣品在進樣室放置12 h含量穩(wěn)定。

3.2 3種溶劑中BE、TH及BE-TH共晶的飽和溶解度測定 25℃下，BE、TH以及BE-TH共晶在乙酸乙酯、甲醇和丙酮中的飽和溶解度結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，隨溶劑的改變，3者的溶解度趨勢呈一定規(guī)律，BE在3種溶劑中的溶解度均高于TH和BETH共晶，其在丙酮中的溶解度最高，甲醇其次，乙酸乙酯中最低；TH和BE-TH共晶均在甲醇溶液中溶解度最高，丙酮次之，乙酸乙酯中最低。

表1 25℃時BE、TH和BE-TH共晶在3種溶劑中的飽和溶解度（x±s）Tab.1 Solubility of BE，TH and BE-TH cocrystal in three medium at 25 ℃（x±s）

表2 BE-TH-溶劑體系中各成分平衡溶解度Tab.2 Equilibrium solubility of each component in BETH-solvent system mmol/L

3.3 相圖的繪制 根據(jù)BE-TH共晶在TH乙酸乙酯、TH甲醇以及TH丙酮溶液中的溶解度，具體結(jié)果見表2，得到三相平衡點，繪制了25℃時BE-TH-溶劑體系的三元相圖。由于BE和TH的物質(zhì)的量分數(shù)相對于溶劑的物質(zhì)的量分數(shù)來說很小，使數(shù)據(jù)全部聚集在三元相圖的頂部，不利于分析，因此在繪制三元相圖的過程中，將BE和TH的物質(zhì)的量分數(shù)均乘以200。圖3為繪制的BE-TH-溶劑體系的三元相圖，筆者以BE-TH-乙酸乙酯體系（圖3-A）為例，將劃分的6個區(qū)域及5個重要節(jié)點歸納為：區(qū)域a和b分別表示BE和TH的飽和溶液，d點和e點為三相點，d點為被BE和BE-TH共晶飽和的溶液體系，e點為被TH和BE-TH共晶飽和的溶液體系，c點是BE-TH共晶的臨界點。de曲線表示共晶在乙酸乙酯中的溶解度曲線，區(qū)域1、2、3分別表示固態(tài)BE、共晶和TH與其乙酸乙酯飽和溶液的兩項平衡區(qū)，區(qū)域4表示固態(tài)共晶、固態(tài)BE與其乙酸乙酯飽和溶液的三相平衡區(qū)，區(qū)域5表示固態(tài)共晶、固態(tài)TH與其乙酸乙酯飽和溶液的三相平衡區(qū)，區(qū)域6是不飽和溶液的單相區(qū)。

從三元相圖可以看出，在3種溶劑中，BE-TH-溶劑體系中化學計量比均明顯穿越共晶穩(wěn)定形成區(qū)。比較3種溶劑中共晶形成區(qū)域的面積大小，結(jié)果為丙酮＞甲醇＞乙酸乙酯，丙酮更容易形成共晶，因此筆者選擇丙酮作為溶劑，以BE和TH物質(zhì)的量1∶1的比例通過溶劑揮發(fā)法制備得到單一共晶。

3.4 體外溶出度評價 BE原料藥、TH原料藥、BE-TH物理混合以及BE-TH共晶在人工腸液和人工胃液中的溶出結(jié)果，以時間為橫坐標，累積溶出百分率為縱坐標作圖，結(jié)果見圖4-7。

圖3 25℃下BE-TH-溶劑體系在乙酸乙酯（A）、甲醇（B）、丙酮（C）中的三元相圖Fig 3 Ternary phase diagrams of BE-TH-solvent system in ethyl acetate(A)，methanol(B)and acetone(C)at 25℃

圖4 BE、BE-TH物理混合以及BE-TH共晶在人工腸液中 BE 的累積溶出度（x±s，n=3）Fig.4 Cumulative dissolution of BE of BE，BE-TH physical mixing and BE-TH eutectic in simulated intestinal fluid（x±s，n=3）

圖5 TH、BE-TH物理混合以及BE-TH共晶在人工腸液中TH的累積溶出度Fig.5 Cumulative dissolution of TH of BE，BE-TH physical mixing and BE-TH eutectic in simulated intestinal fluid（x±s，n=3）

圖6 BE、BE-TH物理混合以及BE-TH共晶在人工胃液中 BE 的累積溶出度（x±s，n=3）Fig.6 Cumulative dissolution of BE of BE，BE-TH physical mixing and BE-TH eutectic in simulated gastric fluid（x±s，n=3）

圖7 TH、BE-TH物理混合以及BE-TH共晶在人工胃液中 TH 的累積溶出度（x±s，n=3）Fig.7 Cumulative dissolution of TH of BE，BE-TH physical mixing and BE-TH eutectic in simulated gastric fluid（x±s，n=3）

計算人工腸液中360 min內(nèi)的累積溶出度，結(jié)果顯示原料藥組BE的溶出度為37.29%±1.56%，BE-TH物理混合中BE的溶出度是40.62%±2.78%，而BE-TH共晶體系中BE的溶出度增加至51.39%±2.98%，分別是原料藥和物理混合的1.38和1.27倍，均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。TH在360 min內(nèi)的累積溶出度結(jié)果顯示，BE-TH共晶與TH原料藥及BE-TH物理混合物無統(tǒng)計學差異。以30 min內(nèi)的累積溶出量為縱坐標，時間為橫坐標，計算30 min內(nèi)BE的溶出速率，結(jié)果顯示BE原料藥（0.11mg/min）＜BE-TH共晶（0.16 mg/min）＜BE-TH物理混合（0.17 mg/min），表明BE-TH共晶能夠促進BE的溶解。計算TH在30 min內(nèi)溶出速率，結(jié)果顯示BE-TH共晶（0.28 mg/min）＜BE-TH 物理混合（0.29 mg/min）＜TH原料藥（0.44 mg/min），表明BE-TH共晶對TH起到了緩釋作用。

計算人工胃液中360 min內(nèi)的累積溶出度，結(jié)果顯示原料藥組BE的溶出度為9.94%±2.10%，BE-TH物理混合中BE的溶出度是11.15%±3.15%，BE-TH共晶體系中BE的溶出度增加到了20.08%±1.25%，分別是原料藥和物理混合物的2.02和1.80倍，均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。TH在360 min內(nèi)的累積溶出度結(jié)果顯示，BE-TH共晶與TH原料藥及BE-TH物理混合物無統(tǒng)計學差異。以30 min內(nèi)的累積溶出量為縱坐標，時間為橫坐標，計算BE在30 min內(nèi)的溶出速率，結(jié)果顯示BE原料藥（0.03 mg/min）＜BE-TH 物理混合（0.05 mg/min）＜BETH共晶（0.08 mg/min），表明BE-TH共晶能夠促進BE的溶解。計算TH在30 min內(nèi)的溶出速率，結(jié)果顯示BE-TH共晶（0.30 mg/min）＜TH原料藥（0.31 mg/min）＜BE-TH 物理混合（0.35 mg/min），表明BE-TH共晶同樣對TH起到了緩釋作用。

4 討論

中藥活性成分研究是中藥現(xiàn)代化的重要組成部分，而溶解度低的難溶性藥物常常會影響藥物的溶出速率，造成其口服生物利用度低，嚴重限制了臨床應(yīng)用。因此通過適宜的制劑手段，改善中藥難溶性成分的溶出度和口服吸收，提高其生物利用度，已經(jīng)成為中藥現(xiàn)代化研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，共晶技術(shù)是改善中藥難溶性成分溶出度和口服吸收的重要制劑手段[20]。分子間的氫鍵作用是共晶形成中最重要的1種分子作用力[21]，藥物活性分子在形成共晶后，由于空間堆積方式的變化，某些理化性質(zhì)也會發(fā)生相應(yīng)的改變[22]，為提高難溶性藥物的生物利用度提供可能性。

溶劑揮發(fā)法制備共晶時，對于溶劑的選擇至關(guān)重要，合適的溶劑才能制備出純凈的共晶產(chǎn)物，而不良溶劑將導致單組分的析出。如果藥物活性成分在溶劑中的溶解度與配體的溶解度相差很大，比較容易形成非對稱三元相圖，那將不利于純共晶的制備[23]。所以常常會選擇API和CCF在該溶劑中溶解度相近的溶劑，且共晶溶解度應(yīng)低于活性成分的溶解度，通過攪拌使分子間充分作用，以制備出單一共晶。在本研究中，筆者選擇制備共晶的常用溶劑甲醇、乙酸乙酯和丙酮，是鑒于黃芩素與茶堿能夠溶于此3種溶劑中，且在3種溶劑中的溶解度相差不大。然后通過繪制共晶成分與溶劑體系的三元相圖的方法篩選溶劑，為共晶制備工藝的確定提供理論支持[24]，進而可以制備出高純度的共晶產(chǎn)物。

文章以BE和TH為原料藥，根據(jù)BE-TH共晶在TH乙酸乙酯、TH甲醇以及TH丙酮溶液中的溶解度，得到三相平衡點，繪制BE-TH-溶劑體系的三元相圖，篩選出丙酮作為制備BE-TH共晶的最佳溶劑，為BE-TH共晶的擴大生產(chǎn)及共晶的熱力學研究提供參考。體外溶出實驗結(jié)果表明共晶的形成能夠促進難溶性成分BE的體外釋放，并且對TH的釋放度起到一定緩釋作用，這一現(xiàn)象可能是由晶型的排列以及共結(jié)晶過程導致的兩者性質(zhì)的改變[25]。而共晶對TH的緩釋效果，可以歸因于難溶性成分對藥物釋放的阻礙作用[26]，從而減少了TH對胃腸道的刺激和服藥次數(shù)，為BE-TH共晶的進一步研究和臨床應(yīng)用提供了借鑒。