對(duì)一測(cè)多評(píng)法測(cè)定蜂膠類保健食品中芹菜素等5種成分含量的評(píng)價(jià)研究

楊 玲,劉成浩,韓蕭茜,劉 齊,馮曼琳,杜 勇

(北京市藥品檢驗(yàn)所,北京 102206)

蜂膠為蜜蜂科昆蟲意大利蜂(ApismelliferaL)工蜂采集的植物樹(shù)脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有黏性的固體膠狀物。性苦,辛,寒。歸脾,胃經(jīng)。用于體虛早衰,高脂血癥等[1]。由于蜂膠具有多種藥理作用,故在保健食品中得到了較為廣泛的應(yīng)用。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)查詢結(jié)果,截止到2018年9月30日,國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口保健食品中以蜂膠為原料的共有1459種,主要功效為提高免疫力、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂等。

黃酮類化合物是蜂膠中的主要活性成分[2-6],其中高良姜素是天然的黃酮醇,具有抗炎、抗過(guò)敏、抗菌、抗氧化、抗肥胖、抗缺氧、清除自由基及抗癌等多種藥理作用[7-9];松屬素(又名喬松素)能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[10],具有抗菌、抗誘變、抗氧化、殺蟲、抗腫瘤、局麻等多種藥理活性[11-12];白楊素(又名柯因)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抗增殖活性,對(duì)某些結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、白血病、黑色素瘤細(xì)胞系具有促凋亡作用[13];山奈酚可抗癌、抗炎、保護(hù)肝臟及心肌、防治動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松及糖尿病[14];芹菜素具有抗炎、抗痛風(fēng)、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能[15]。上述化合物的藥理作用與其保健功效相關(guān),可作為質(zhì)控指標(biāo)。除此之外,還有楊梅苷、蘆丁、槲皮素等其他黃酮。但是很多研究顯示中國(guó)蜂膠中可能不含有楊梅苷、蘆丁[16-20],或是含量極少。蜂膠中極性相似的成分很多,保留時(shí)間接近,很容易造成人為混淆。例如蘆丁與3,4-二甲氧基肉桂酸,槲皮素與短葉松素,液相保留時(shí)間相近,紫外光譜相似[2]。符軍放[18]在對(duì)9個(gè)主產(chǎn)區(qū)的30批蜂膠樣品成分分析中發(fā)現(xiàn),槲皮素含量甚微,楊梅苷和蘆丁均未檢測(cè)到。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的12批樣品中,均未檢出楊梅苷,有3批未檢出蘆丁,槲皮素含量也較低。故選擇芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素作為產(chǎn)品的質(zhì)量控制指標(biāo)加以測(cè)定。

國(guó)標(biāo)GB/T 19427-2003中采用液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用方法測(cè)定楊梅苷等8種黃酮[21],中國(guó)藥典2015年版采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定蜂膠中白楊素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯和喬松素[1]。李熠等[22],于世鋒等[23],吳毅等[24]采用超高效液相色譜法(UPLC)及HPLC同時(shí)測(cè)定蜂膠中的多種黃酮及酚酸的含量。但目前絕大多數(shù)蜂膠類保健食品都采用測(cè)定總黃酮的含量以控制產(chǎn)品質(zhì)量,此類方法專屬性差,精確度低,難以準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)品質(zhì)量,同時(shí)也增加了造假及使用替代原料的風(fēng)險(xiǎn)。蜂膠中化學(xué)成分及有效成分的多樣性、復(fù)雜性,使得測(cè)定單一的功效或指標(biāo)性成分難以準(zhǔn)確表達(dá)產(chǎn)品質(zhì)量,只有對(duì)其中的多種有效成分或主要成分進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià),才能達(dá)到全面控制質(zhì)量的目的。多指標(biāo)質(zhì)控高昂的檢測(cè)成本反過(guò)來(lái)又限制了此種質(zhì)量控制模式在實(shí)際生產(chǎn)、科研、監(jiān)督中的應(yīng)用。面對(duì)這種情況,急需建立一種科學(xué)、高效的質(zhì)量控制方法。一測(cè)多評(píng)法整合了內(nèi)標(biāo)、校正因子、紫外百分吸收系數(shù)等方法的優(yōu)勢(shì),借助待測(cè)物中有效成分內(nèi)在的函數(shù)和比例關(guān)系,以一個(gè)對(duì)照品為參照物,建立該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子,并通過(guò)其計(jì)算含量,實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)測(cè)定。該方法已經(jīng)在中藥材[25-30]、中成藥[31-35]及食品[36]的質(zhì)量評(píng)價(jià)當(dāng)中得到了應(yīng)用。

本研究參考文獻(xiàn)[37-39]的技術(shù)要求,建立一種簡(jiǎn)便高效的蜂膠類保健食品中多個(gè)黃酮組分的含量測(cè)定方法。以芹菜素為參照物,采用“一測(cè)多評(píng)法”測(cè)定芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素的含量,并采用回歸方程法同步測(cè)定并加以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芹菜素(批號(hào):111901-201603,純度99.2%)、山奈酚(批號(hào):110861-201611,純度95.5%)、白楊素(111701-200501,純度100%)及高良姜素(批號(hào):111699-201703,純度99.6%) 中國(guó)食品藥品檢定研究院;松屬素(MKCF0471,純度99%) Sigma公司;甲醇 色譜純,默克股份兩合公司;磷酸 色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水 重蒸餾水;測(cè)定用樣品為蜂膠液和蜂膠軟膠囊 分別由不同廠家生產(chǎn)。

Waters e2695高效液相色譜儀(方法學(xué)考察所用) 沃特世公司;島津LC-20AD高效液相色譜儀 日本島津制作所;Aglient-1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;XS-205型電子分析天平 梅特勒-托利多集團(tuán);SB-25-12D型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素標(biāo)準(zhǔn)品適量,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為41.74、99.70、185.2、205.2、220.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2 供試品提取條件的優(yōu)化 參考文獻(xiàn)[1-2,7-9]提取方法,取編號(hào)為001的蜂膠液樣品適量,混勻,精密稱取0.5 g各2份,分別以甲醇、乙醇為提取溶劑,室溫超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)30 min,進(jìn)樣后記錄峰面積,以峰面積積分值為縱坐標(biāo),待測(cè)組分為橫坐標(biāo),制作柱形圖后比較最優(yōu)提取結(jié)果,確定提取溶劑后同法操作,精密稱取0.5 g各2份,考察15、30、45 min 3種提取時(shí)間,進(jìn)樣后記錄峰面積,以峰面積積分值為縱坐標(biāo),待測(cè)組分為橫坐標(biāo),制作柱形圖后比較最優(yōu)提取結(jié)果,確定最佳提取時(shí)間。

1.2.3 供試品溶液制備 取蜂膠液適量混勻,或蜂膠軟膠囊內(nèi)容物適量混勻,精密稱取0.5 g(蜂膠液),0.25 g(蜂膠軟膠囊內(nèi)容物)置于25 mL容量瓶中,加甲醇20 mL溶解,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)30 min,冷卻后用甲醇定容至刻度,搖勻。以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),取濾液,待測(cè)。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Aglient ZORBAX SB-C18,柱長(zhǎng)250 mm,內(nèi)徑4.6 mm,粒徑5 μm;流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(洗脫程序見(jiàn)表1);檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm;柱溫為30 ℃;流速為:1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL[21]。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution sequence

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算回歸方程。

1.2.5.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算 本研究采用以多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算所得的fsi取平均值作為定量用fsi。計(jì)算公式為:fsi=(As×Ci)/(Ai×Cs),式中:fsi為相對(duì)校正因子,As為參照物標(biāo)準(zhǔn)品s峰面積,Cs為參照物標(biāo)準(zhǔn)品s濃度,Ai為待測(cè)成分標(biāo)準(zhǔn)品i峰面積,Ci為待測(cè)成分標(biāo)準(zhǔn)品i濃度。

1.2.5.3 相對(duì)保留時(shí)間的確定 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣,記錄5組分的保留時(shí)間,并分別計(jì)算山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素的相對(duì)保留時(shí)間。

1.2.5.4 精密度試驗(yàn) 取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄各組分色譜峰峰面積,并計(jì)算RSD值。

1.2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為001的蜂膠液樣品,按1.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于制備后0、4、8、12、24 h注入液相色譜儀,記錄各組分峰面積,并計(jì)算RSD值。

1.2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為001的蜂膠液樣品,按照1.2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算芹菜素等5組分的含量,并計(jì)算RSD值。

1.2.5.7 回收率試驗(yàn) 取編號(hào)為001的樣品,精密稱定9份,每份0.25 g,分成3組,每組3份,分別精確添加含芹菜素0.5218 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.10、0.15、0.20 mL,含山奈酚0.9970 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.10、0.15、0.20 mL,含白楊素1.024 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.50、0.75、1.0 mL,含松屬素1.041 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.50、0.75、1.0 mL,含高良姜素0.9621 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.50、0.75、1.0 mL,按照“1.2.3”制備供試品溶液,并測(cè)定,分別計(jì)算回收率:

回收率(%)=(測(cè)得量-樣品含量)/加入量×100

1.2.5.8 系統(tǒng)耐用性考察 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,進(jìn)樣分析,計(jì)算以芹菜素為參照物的其余4種成分的相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間,分別采用3臺(tái)不同品牌的高效液相色譜儀,3根不同型號(hào)的色譜柱,及在同一臺(tái)高效液相色譜儀上選擇3種不同的柱溫和3種不同的流速進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 一測(cè)多評(píng)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的測(cè)定結(jié)果比較 取以蜂膠為單一原料的保健食品12批,其中001、002為蜂膠液,其余為蜂膠軟膠囊,按照1.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定,并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算芹菜素等5組分的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及空白色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)品圖譜中,芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的濃度分別為5.218、12.46、23.15、25.65、27.50 μg/mL;供試品由001號(hào)蜂膠液制備,為陽(yáng)性樣品;空白為樣品空白。由圖1可見(jiàn),樣品中各個(gè)組分分離情況良好,空白無(wú)干擾。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(A),供試品色譜圖(B),空白色譜圖(C)Fig.1 HPLC chromatogram of control(A),sample(B),blank(C)注:圖A中,1.芹菜素;2.山奈酚;3.白楊素;4.松屬素;5.高良姜素。

2.2 提取方法的優(yōu)化結(jié)果

參考中國(guó)藥典等相關(guān)文獻(xiàn),選擇甲醇和乙醇作為提取溶劑進(jìn)行考察。從圖2可見(jiàn),以甲醇為提取溶劑時(shí),白楊素和高良姜素峰面積積分值稍高,其余三組分無(wú)明顯差別,故選擇甲醇為提取溶劑。從圖3可見(jiàn),芹菜素、山奈酚、白楊素的峰面積積分值在超聲處理30 min時(shí)為最大,松屬素及高良姜素的峰面積積分值在不同處理時(shí)間時(shí)基本一致,故選擇提取時(shí)間為30 min。

表2 芹菜素等5種組分標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Calibration cruve and linear range

表3 山奈酚、白楊素、松屬素及高良姜素相對(duì)校正因子Table 3 Relative correcting factors of kaempferol,chrysin,pinocembrin and galangin

圖2 提取溶劑考察結(jié)果Fig.2 The comparison of extraction solvent

圖3 提取時(shí)間考察結(jié)果Fig.3 The comparison of extraction time

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系 按1.2.5.1項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素在1.044～20.87、2.492～49.85、4.630～92.60、5.130～102.6、5.500～110.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均為0.9999,結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算 本研究以芹菜素為參照物,根據(jù)不同進(jìn)樣量分別計(jì)算山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的相對(duì)校正因子,并求平均值作為最終結(jié)果,山奈酚等4組分的相對(duì)校正因子分別為1.1929、0.5938、2.7847、0.9727,見(jiàn)表3。

2.3.3 相對(duì)保留時(shí)間的確定 色譜峰的準(zhǔn)確定位是保證QAMS法應(yīng)用的前提,本研究以芹菜素為參照物,分別計(jì)算山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的相對(duì)保留時(shí)間(計(jì)算公式:ras=tRa/tRstRa為待測(cè)成分的保留時(shí)間,tRs為內(nèi)參物的保留時(shí)間,ras為二者的比值即相對(duì)保留時(shí)間),以確定其位置。5組分的相對(duì)保留時(shí)間分別為1.000、1.124、3.582、4.106、4.388,可作為各個(gè)組分的定性依據(jù),見(jiàn)表4。在本研究中,每針的分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)85 min,而松屬素和高良姜素的保留時(shí)間分別為64和68 min,相對(duì)保留時(shí)間較為接近,如調(diào)整梯度,每針的分析時(shí)間將繼續(xù)加長(zhǎng)。故在今后的含量測(cè)定中,可用增加一個(gè)對(duì)照品的方式來(lái)輔助確定二者的準(zhǔn)確位置。

表4 5種成分相對(duì)保留時(shí)間Table 4 Relative retention time of 5 kinds of components

2.3.4 精密度試驗(yàn) 按1.2.5.4項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn),芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素峰面積的RSD分別為0.3%、0.1%、0.2%、0.2%、0.2%,表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.2.5.5項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn),取混合對(duì)照品溶液,分別于配制后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析,記錄各組分峰面積,結(jié)果芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素峰面積的RSD分別為1.1%、0.7%、1.2%、1.0%、0.7%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按1.2.5.6項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn),芹菜素、山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5,RSD分別為0.9%、1.0%、0.9%、1.1%、0.7%,表明該方法重復(fù)性良好。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果重復(fù)性考察Table 5 Reproducibility test results

表6 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Table 6 Results of recovery test

續(xù)表

表7 不同色譜柱測(cè)得相對(duì)校正因子Table 7 Relative correcting factors determined by different columns

表8 不同儀器測(cè)得相對(duì)校正因子Table 8 Relative correcting factors determined by different instruments

表9 不同流速測(cè)得相對(duì)校正因子Table 9 Relative correcting factors determined by different velocity

表11 不同色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間Table 11 Relative retention times determined by different columns

2.3.7 回收率試驗(yàn) 按1.2.5.7項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表6,芹菜素等5組分的加標(biāo)回收率在96.54%～102.06%之間,表明各個(gè)組分回收率良好。

2.3.8 系統(tǒng)耐用性考察 按1.2.5.8項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn),更換儀器和色譜柱后,相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD為1.3%～3.1%,表明此方法可適用于不同的色譜系統(tǒng)及不同的色譜柱。另外,在同一色譜系統(tǒng)中采用不同的流速和柱溫進(jìn)行試驗(yàn),相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD為0.3%～1.0%,表明此方法可適用于不同的試驗(yàn)環(huán)境。另外在更換不同的色譜柱后,考察山奈酚等4組分的相對(duì)保留時(shí)間,RSD為1.6%～2.1%,表明使用不同的色譜柱,相對(duì)保留時(shí)間變化幅度較小,可準(zhǔn)確定位,相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7～表11。

表10 不同柱溫測(cè)得相對(duì)校正因子Table 10 Relative correcting factors determined by different column temperature

2.4 一測(cè)多評(píng)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的測(cè)定結(jié)果比較

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法(SCM)和一測(cè)多評(píng)法(QAMS)分別計(jì)算12批樣品(其中001、002為蜂膠液,其余為蜂膠軟膠囊)中山奈酚、白楊素、松屬素、高良姜素的含量,結(jié)果見(jiàn)表12。兩種方法測(cè)定結(jié)果相對(duì)平均偏差(RAD)在0.5%～2.1%之間,測(cè)定結(jié)果基本一致。

表12 樣品測(cè)定結(jié)果Table 12 Results of sample determination

3 結(jié)論

本研究采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定以蜂膠為單一原料的保健食品中芹菜素等5種組分的含量,并同時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法加以驗(yàn)證,通過(guò)12批樣品的測(cè)定,兩種方法得到的含量值相對(duì)平均偏差為0.5%～2.1%,結(jié)果基本一致,證明本方法準(zhǔn)確可靠,可以在對(duì)蜂膠中5種組分的含量進(jìn)行測(cè)定的同時(shí),節(jié)約對(duì)照品的使用,提高檢驗(yàn)效率。