基于生物熱力學(xué)的不同產(chǎn)地柴胡抑菌活性評(píng)價(jià)

趙艷丹,胡相卡,馬 悅,史淑丹,鄭 巖,邢炳權(quán),劉雅茹,孫玉琦,代春美

(錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121001)

柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根?，F(xiàn)代藥理研究表明,柴胡具有解熱、抗菌、抗炎、保肝、抗病毒、抗腫瘤等作用,柴胡水提物對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用[1-3]。柴胡皂苷(Saikosaponins,SS)是柴胡主要生物活性成分和化學(xué)指標(biāo),柴胡皂苷a和柴胡皂苷d是有效活性成分,為其重要的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[4-6]。但是,中藥的指標(biāo)成分不一定為有效成分,即使為有效成分,它的含量與藥效也不一定有直接聯(lián)系。檢測(cè)任何一種或幾種成分均不能反映其整體療效。

微量熱法為生物熱力學(xué)的主要研究手段之一,可測(cè)定生物機(jī)體在中藥材等作用下生長(zhǎng)代謝過(guò)程的能量轉(zhuǎn)移和熱變化,通過(guò)獲得的熱力學(xué)信息,可以實(shí)時(shí)、連續(xù)、在線監(jiān)測(cè)生物體的生長(zhǎng)代謝情況及在藥材作用下的變化情況,從而表征藥材對(duì)生物機(jī)體的生長(zhǎng)代謝影響。該方法具有靈敏、普適性好、準(zhǔn)確、在線、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的特點(diǎn),已在很多領(lǐng)域得到應(yīng)用[7-10]。熱力學(xué)理論則反映了整體觀念,生物活性檢測(cè)與化學(xué)含量測(cè)定相比,具有更大的優(yōu)勢(shì)。

金黃色葡萄球菌可引起人和動(dòng)物的多種常見(jiàn)疾病,隨著抗生素類(lèi)藥物治療細(xì)菌感染的廣泛應(yīng)用,取得療效的同時(shí),也帶來(lái)了耐藥性、過(guò)敏反應(yīng)、毒性反應(yīng)等諸多問(wèn)題。為了克服這些弊端,世界各地的醫(yī)藥工作者漸漸地將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向天然藥物,全球掀起了開(kāi)發(fā)和研制天然藥物的浪潮[11]。本研究以金黃色葡萄球菌為測(cè)試菌,利用微量熱法,考察不同產(chǎn)地柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌CMCC(B)26001(批號(hào)26001-12a) 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;培養(yǎng)基:LB肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;不同產(chǎn)地的9批S1-S9柴胡藥材 河北柴胡S1,山西柴胡S2-S5,陜西柴胡S6-S9;柴胡皂苷a對(duì)照品(批號(hào)110777-200507,純度為93.2%)、柴胡皂苷d對(duì)照品(批號(hào)110778-200505,純度為97.3%) 均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇 色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氨水 分析純,洛陽(yáng)大學(xué)化學(xué)試劑;正丁醇 分析純,山東旭晨化工試劑。

TAM Air微量熱儀 瑞典Thermometric公司;L-2130型高效液相色譜儀 日本日立公司;L-2455DAD型檢測(cè)器 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柴胡的HPLC 測(cè)定

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取柴胡皂苷a 10.36 mg和柴胡皂苷d 12.51 mg,置于25 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,得到含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用HPLC測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取柴胡樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)各10 g,8倍量水回流提取2次,每次1 h,合并提取液,濃縮,真空干燥得柴胡浸膏[12]。20 mL水溶解,飽和正丁醇萃取3次,每次60 mL,再用5%氨水洗2次,每次50 mL,分取飽和正丁醇液蒸干,甲醇溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?0 mL,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),得柴胡供試品。

1.2.1.3 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱(250 mm×46 mm,5 μm);以乙腈為流動(dòng)相A,水為流動(dòng)相B,按表1條件進(jìn)行梯度洗脫;流速:1.0 mL/min,柱溫:30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm[13]。

1.2.1.4 方法學(xué)考察 經(jīng)考察,樣品的穩(wěn)定性,儀器的精密度,方法的重復(fù)性良好,RSD小于2.0%,符合要求。分別取上述不同產(chǎn)地柴胡供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀,記錄60 min內(nèi)的色譜圖,以峰面積計(jì)算柴胡藥材中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.2 柴胡微量熱活性檢測(cè)

1.2.2.1 供試品溶液的制備 按照1.2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備所得浸膏,以滅菌三次蒸餾水為溶劑,配制成1 g/mL的溶液(以柴胡藥材計(jì))。

1.2.2.2 微量熱活性的測(cè)定 在 37 ℃,測(cè)定金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝熱譜曲線(空白對(duì)照組)。采用安瓿法,在凈化工作臺(tái)內(nèi),每個(gè)安瓿精確加入5 mL的LB培養(yǎng)基,接種金黃色葡萄球菌,菌接種量為1×106CFU/mL,加入一定量柴胡溶液,使各安瓿藥液終濃度為2 mg/mL,混勻,加蓋密封,放入微量熱儀中。37 ℃培養(yǎng),記錄細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝曲線。

1.2.2.3 生物熱力學(xué)參數(shù) 金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)時(shí)間曲線,P1、P2、T1和T2分別是兩個(gè)峰的最大功率和出峰時(shí)間,k是峰的最大生長(zhǎng)速率常數(shù),I為抑制率,tG為細(xì)菌傳代時(shí)間。

計(jì)算公式如下:Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0kt,其中P0是時(shí)間t=0的熱流功率,Pt是時(shí)間t的熱流功率[14]。由 tG=(ln2)/k得出不同條件下的細(xì)菌傳代時(shí)間tG。細(xì)菌生長(zhǎng)抑制率定義為 I=(k0-k1)/k0,式中k0為金黃色葡萄球菌在正常條件下的生長(zhǎng)速率常數(shù),k1為金黃色葡萄球菌在不同藥物作用下的生長(zhǎng)速率常數(shù)。I值越大,藥物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)。

1.2.2.4 色譜峰峰面積與抑制率I的相關(guān)性分析 為了進(jìn)一步說(shuō)明柴胡發(fā)揮抑菌作用的主要活性成分,本研究采用相關(guān)分析法,對(duì)9批次柴胡藥材的6個(gè)共有色譜峰峰面積與抑制率I進(jìn)行Spearman雙變量相關(guān)分析[15-16]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3次,取其平均值。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地柴胡HPLC分析

2.1.1 不同產(chǎn)地柴胡樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)的譜圖 根據(jù)1.2.1.3色譜條件,測(cè)定柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量,記錄60 min內(nèi)的色譜圖。其標(biāo)準(zhǔn)品溶液譜圖見(jiàn)圖1(A)。確定了6個(gè)特征峰為共有色譜峰,見(jiàn)圖1(B)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC色譜圖(A)、 柴胡樣品的HPLC共有色譜圖(B)Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution(A), Common HPLC chromatogram of Bupleurum chinense(B)注:A為混合標(biāo)準(zhǔn)品,B為樣品的共有峰;1～6號(hào)峰為共有色譜峰,其中3號(hào)峰為 柴胡皂苷a,4號(hào)峰為柴胡皂苷d。

2.1.2 不同產(chǎn)地柴胡HPLC檢測(cè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積 在柴胡的HPLC色譜圖中,由于4號(hào)峰分離度較好,峰面積較穩(wěn)定,保留時(shí)間適中,且為柴胡主要藥理活性成分之一,故選定其作為參照峰,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積見(jiàn)表2～表3。

表2 不同產(chǎn)地柴胡HPLC圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間Table 2 Relative retention time of common peak in HPLC chromatogram of Bupleurum chinensis from different habitats

表3 不同產(chǎn)地柴胡HPLC圖譜共有峰相對(duì)峰面積Table 3 Relative peak area of common peak in HPLC chromatogram of Bupleurum chinensis from different habitats

表4 柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量Table 4 Contents of saponins a,d in Bupleurum chinense

圖2 不同產(chǎn)地柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)熱譜圖Fig.2 Power-time curve of Staphylococcus aureus in Bupleurum chinense from different habitats

2.1.3 不同產(chǎn)地柴胡HPLC含量測(cè)定 根據(jù)HPLC檢測(cè)的峰面積,計(jì)算柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量,其結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示,山西柴胡S3中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量最高,河北柴胡S1中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量最低,山西柴胡和陜西柴胡中柴胡皂苷a和d的含量高于河北柴胡。

2.2 柴胡提取物的生物活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 不同產(chǎn)地柴胡提取物作用于金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)熱譜圖 金黃色葡萄球菌在不同產(chǎn)地柴胡作用下的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)熱譜圖(圖2)。在相同的條件下,實(shí)驗(yàn)結(jié)果有良好的重現(xiàn)性。各產(chǎn)地柴胡作用于金黃色葡萄球菌的譜圖形狀相似,相對(duì)空白對(duì)照組,各樣品最高峰的峰高、出峰的時(shí)間不同。

2.2.2 不同產(chǎn)地柴胡提取物作用于金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù) 由金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)熱譜圖(圖2)獲得不同產(chǎn)地的柴胡作用于金黃色葡萄球菌的熱力學(xué)參數(shù),如表5所示。與空白組相比,不同產(chǎn)地柴胡明顯降低了金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的最大發(fā)熱功率P2,表明柴胡不同程度地抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)。抑制率I值反映了不同產(chǎn)地柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的強(qiáng)弱。

表5 不同產(chǎn)地的柴胡作用于金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝熱力學(xué)參數(shù)Table 5 Thermokinetics parameters of Staphylococcus aureus growth in the presence of Bupleurum chinense from different habitats

結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地的柴胡抑制率在7.14%～53.06%,山西和陜西柴胡抑菌活性高于河北柴胡。其中山西柴胡S3對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率I為53.06%,其值最大,抑菌作用最強(qiáng)。由生長(zhǎng)代謝曲線可以看出,不同產(chǎn)地的柴胡作用于金黃色葡萄球菌的曲線相似,峰形后移,傳代時(shí)間tG延長(zhǎng)。說(shuō)明生長(zhǎng)代謝時(shí)間延長(zhǎng),也表明柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。其中,山西柴胡S3的傳代時(shí)間為150.68 min,其傳代時(shí)間最長(zhǎng),說(shuō)明其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)。

2.2.3 共有色譜峰峰面積與抑制率I的相關(guān)分析 采用SPSS軟件對(duì)共有色譜峰峰面積與生物熱力學(xué)參數(shù)抑制率I進(jìn)行相關(guān)分析,其結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 共有色譜峰峰面積與抑制率相關(guān)分析結(jié)果Table 6 Analysis results of correlation between peak area of common chromatographic peaks and inhibition rate

其中5個(gè)峰的相關(guān)系數(shù)R值均大于0.5,說(shuō)明了這些成分與抑制率有較高的相關(guān)性。其中3號(hào)峰柴胡皂苷a的相關(guān)系數(shù)為0.783,4號(hào)峰柴胡皂苷d的相關(guān)系數(shù)為0.717,貢獻(xiàn)度較大,顯著相關(guān)(P<0.05)。說(shuō)明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d與柴胡抑制金黃色葡萄球菌活性存在著密切的關(guān)聯(lián)性。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)有中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)多為一個(gè)或幾個(gè)活性成分的指標(biāo),但單純的化學(xué)檢測(cè)無(wú)法反映各成分與藥效之間的關(guān)系。目前中藥質(zhì)量差異較大,中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路傾向于藥材及有效部位,有效單體作用的“分離解析研究”,而疏于“還原-整合”思想,影響了中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。以熱力學(xué)理論指導(dǎo)的生物活性測(cè)定與傳統(tǒng)化學(xué)成分測(cè)定相比,反映了中藥整體的效應(yīng)[17]。

柴胡皂苷是柴胡主要化學(xué)指標(biāo)和生物活性成份,根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為柴胡皂苷a、b、c和d等,柴胡皂苷a、d活性最強(qiáng),研究最廣。本研究以不同產(chǎn)地柴胡、柴胡皂苷為對(duì)象,基于生物熱力學(xué)活性對(duì)柴胡的抑菌作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明柴胡皂苷含量最高的山西柴胡S3抑菌作用最強(qiáng)。進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)分析表明,柴胡皂苷a的峰面積與抑制率有最高的相關(guān)系數(shù),說(shuō)明柴胡皂苷a是其生物活性起作用的主要物質(zhì)。其次,柴胡皂苷d相關(guān)系數(shù)僅次于柴胡皂苷a,對(duì)柴胡的生物活性也起著重要的作用。

本研究對(duì)不同產(chǎn)地柴胡的抑菌作用進(jìn)行了研究與分析,用熱力學(xué)方法獲得主要熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)并與化學(xué)成分進(jìn)行相關(guān)性分析。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn):將化學(xué)成分檢測(cè)與生物力學(xué)評(píng)價(jià)相結(jié)合,構(gòu)建綜合的評(píng)控模式,有利于對(duì)藥材進(jìn)行更合理的評(píng)控[18-19]。通過(guò)HPLC色譜峰峰面積與生物熱力學(xué)參數(shù)抑制率I的相關(guān)性研究,初步探討了柴胡的活性成分,同時(shí)也為柴胡的質(zhì)量控制提供參考。微量熱法與傳統(tǒng)的化學(xué)檢測(cè)方法相比,體現(xiàn)了中藥作用的整體性。更客觀、全面地評(píng)價(jià)柴胡的生物質(zhì)量,為中藥藥效物質(zhì)篩選提供思路與參考,也為其它藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新思路。