基于動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定枸杞中44種農(nóng)藥殘留

(蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所,甘肅蘭州 730050)

枸杞(LyciumbarbarumL.)是一種重要的藥食同源農(nóng)產(chǎn)品,深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。枸杞因多適宜在鹽堿地和退耕還林地種植,使其成為西北地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)作物[2],主要分布在寧夏、甘肅、新疆、青海等地。由于其含糖量高,病蟲(chóng)害情況嚴(yán)重,目前主要是以化學(xué)藥物防治[3],但生產(chǎn)者為了確保產(chǎn)量,常常對(duì)其不規(guī)范使用化學(xué)藥物,造成了農(nóng)藥殘留超標(biāo),這不僅對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染,更可能對(duì)消費(fèi)者的身體健康產(chǎn)生直接或者潛在的危害。因此,建立枸杞中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法對(duì)于保障枸杞市場(chǎng)的質(zhì)量和人們的健康具有重要的意義。

目前,枸杞中農(nóng)藥殘留儀器檢測(cè)技術(shù)有很多,主要是氣相色譜法[4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3,8-10]等。其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種具有靈敏度高、分析速度快、高通量等特性的定性定量分析方法,在多種農(nóng)藥殘留分析中被廣泛應(yīng)用。目前,利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)模式多數(shù)是采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,對(duì)動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的檢測(cè)還鮮有報(bào)道。羅輝泰[11]在測(cè)定飼料中藥物殘留采用了動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式,在保證準(zhǔn)確定量的情況下仍具有較高的檢測(cè)靈敏度,但是關(guān)于枸杞中農(nóng)藥殘留采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行測(cè)定的至今尚未見(jiàn)報(bào)道。動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的優(yōu)勢(shì)是根據(jù)色譜分析時(shí)間對(duì)每個(gè)組分的保留時(shí)間窗口進(jìn)行動(dòng)態(tài)分配,僅當(dāng)組分流出時(shí)才被采集,這種科學(xué)的分段方式有效減少了同時(shí)掃描不同的離子對(duì)的數(shù)目,并一定程度上提高了駐留時(shí)間,大大提高了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的分析效率。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象枸杞干果含水量低,且含有多糖、有機(jī)酸、類胡蘿卜素、脂肪等物質(zhì)[12],在測(cè)定時(shí)需要充分提取和凈化,因此本實(shí)驗(yàn)考慮從復(fù)水量、提取溶劑、凈化填料和配比等條件優(yōu)化來(lái)提高提取凈化效果,通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定建立簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確可靠的同時(shí)測(cè)定44種農(nóng)藥多殘留分析方法,為枸杞中多種農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)提供科學(xué)的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞 蘭州市售;甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂(lè)果、霜霉威、多菌靈、噻菌靈、滅多威、噻蟲(chóng)嗪、吡蟲(chóng)啉、樂(lè)果、啶蟲(chóng)脒、硫環(huán)磷、抑霉唑、甲基硫菌靈、甲萘威、嘧霉胺、異丙威、烯酰嗎啉、乙霉威、丙森鋅、嘧菌酯、啶酰菌胺、氟硅唑、戊菌唑、聯(lián)苯肼酯、除蟲(chóng)脲、蟲(chóng)酰肼、氯唑磷、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、苯霜靈、氰霜唑、苯酰菌胺、四螨嗪、辛硫磷、氟苯脲、噻嗪酮、炔螨特、噠螨靈、涕滅威 均為德國(guó)Dr. Ehrenstorfer. Gmbh公司;殺線磷、久效磷、甲基硫環(huán)磷 均為北京曼哈格;氯吡脲、噻螨酮 均為北京鄭翔科技有限公司;以上對(duì)照品純度均≥98.0%。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸 均為色譜純,德國(guó)Merck公司;乙酸銨 HPLC級(jí),美國(guó)Sigma公司;丙酮 色譜純,科密歐化學(xué)試劑有限公司;QuEChERS凈化管填料:乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)40～60 μm、石墨化炭黑(GCB)40～120 μm、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)40～60 μm 均為 美國(guó)Agilent 公司;無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水醋酸鈉、氯化納、檸檬酸二鈉、檸檬酸鈉 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1260HPLC-6460三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;5810R高速低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;A11基本型分析研磨機(jī),KS501圓周振蕩搖床 德國(guó)IKA公司;MS205DU電子天平、BSA224S-CW電子天平 德國(guó)Sartorius公司;EVA32多功能樣品濃縮儀 北京普立泰科公司;VORTEX-5渦旋混勻器 海門(mén)其林貝爾公司;Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取各供試標(biāo)準(zhǔn)品,據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解性用乙腈、甲醇分別制成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃冷藏避光保存,備用;臨用前配制成0.002～0.200 mg/L的44種混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品制備 取枸杞干果樣品,-20 ℃冷凍48 h后立即用分析研磨機(jī)粉碎,精密稱取樣品5 g(精確至0.001 g),置50 mL離心管中,加入10 mL超純水振蕩混勻(復(fù)水處理),再加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈,渦旋1 min,在搖床上振蕩20 min,放入冰箱中-18 ℃冷凍20 min,加入4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉,立即渦旋混合均勻1 min,以4 ℃、3900 r/min離心10 min,取上清液,待凈化。精密移取5.00 mL上清液加到內(nèi)含PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg的15 mL塑料離心管中,渦旋混勻1 min,4 ℃、3900 r/min離心10 min,精密量取2.00 mL上清液于7 mL聚乙烯離心管中,40 ℃水浴中氮吹至近干,加入2.00 mL乙腈-水(3∶2)溶液復(fù)溶,過(guò)0.2 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.2.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 依照1.2.2方法制備樣品提取液,以此基質(zhì)溶液配制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.4 儀器條件 液相色譜條件:色譜柱Water Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),進(jìn)樣量5 μL,柱溫30 ℃,流速0.3 mL/min,后運(yùn)行時(shí)間5 min,梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度條件Table 1 Gradient elution process for liquid phase

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源ESI,動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(d-MRM),正離子模式,霧化氣壓力40 psi,干燥器溫度350 ℃,干燥氣流速10 L/min,毛細(xì)管電壓4000 V,腔電流:0.28 μA。質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 44種農(nóng)藥的質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometric parameters of 44 kinds of pesticides

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MassHunter Quantitative Analysis軟件處理數(shù)據(jù),以MassHunter Quanlitative Analysis和Microsoft Excel 2007軟件分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相梯度洗脫條件的確定 以0.1%甲酸水(a)和乙腈(b)為流動(dòng)相,比較了方案A(0～2 min,90% a;2.1～5 min,90% a→50% a,5～15 min,50% a;15～15.1 min,90% a;15.1～20 min,90% a)和方案B(表1)兩種梯度條件下的44種農(nóng)藥d-MRM色譜圖(見(jiàn)圖1)。從圖1可以看出,方案A出峰時(shí)間相對(duì)集中,峰的重疊會(huì)影響各個(gè)目標(biāo)化合物的峰形及其分離效果,導(dǎo)致響應(yīng)降低。方案B各個(gè)化合物依次出峰,分離效果好,峰形改善,響應(yīng)提高。因此,選擇方案B為本實(shí)驗(yàn)的最佳梯度洗脫條件。

圖1 兩種梯度洗脫方案對(duì)44種農(nóng)藥出峰的影響Fig.1 Effects of two kinds of gradient elution schemes on the peak of 44 kinds of pesticides

2.1.2 流動(dòng)相種類的確定 比較了A:乙腈-水,B:乙腈-0.1%甲酸水溶液,C:乙腈-0.1%乙酸水溶液,D:乙腈-0.1%甲酸2 mmol/L乙酸銨的水溶液4種流動(dòng)相體系下的色譜圖(圖2)。從圖2可以看出,同等測(cè)定條件下,流動(dòng)相體系C下各個(gè)目標(biāo)化合物的響應(yīng)偏低。當(dāng)流動(dòng)相為A、B、D時(shí),從峰的分離度看,在3～5.5 min時(shí)間段內(nèi),A中色譜峰重疊較多,D中色譜峰響應(yīng)偏低;流動(dòng)相A在9～10 min內(nèi)抑霉唑和甲基硫菌靈未完全分離;11～12min內(nèi)A中的三種化合物全部分離,B和D中的嘧霉胺和氯吡脲重疊;從色譜峰的整體響應(yīng)來(lái)看,響應(yīng)強(qiáng)度順序?yàn)锽>A>D。因此,綜合考慮峰的分離效果和響應(yīng)情況,選擇最佳的流動(dòng)相種類為乙腈-0.1%甲酸水溶液。

圖2 流動(dòng)相種類對(duì)44種農(nóng)藥出峰的影響Fig.2 Effects of mobile phase species on the peak of 44 kinds of pesticides

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將44種農(nóng)藥的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 μg/mL)采用自動(dòng)優(yōu)化和手動(dòng)優(yōu)化兩種方式對(duì)其質(zhì)譜條件分別進(jìn)行確定,然后建立全段MRM方法采集44種農(nóng)藥化合物名稱和保留時(shí)間等信息,利用獲得的已知信息轉(zhuǎn)化為動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(d-MRM),d-MRM的建立可避免不分段采集方式中多個(gè)MRM重疊使靈敏度降低的難題,以及分段采集方式中相鄰峰在分段處保留時(shí)間漂移需在兩個(gè)段中均設(shè)置它們的MRM所帶來(lái)的降低分析方法通量的缺陷,d-MRM適合多種農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè),不僅可顯著改善多種化合物負(fù)載循環(huán)時(shí)間,還可提高靈敏度和選擇性。因此,本文以d-MRM方式建立了44種農(nóng)藥的質(zhì)譜條件。

2.3 復(fù)水量的優(yōu)化

枸杞干果含水量低,直接用乙腈提取難以充分滲透到樣品組織內(nèi)部,經(jīng)復(fù)水處理后再提取會(huì)改變提取效率,因此,比較了10、15、20 mL的復(fù)水量對(duì)44種農(nóng)藥的提取效果(見(jiàn)圖3)。從圖3結(jié)果可以看出,除噻蟲(chóng)嗪、吡蟲(chóng)啉、甲基硫菌靈和氟苯脲的回收率整體偏低外,當(dāng)復(fù)水量為10 mL時(shí),甲胺磷、乙酰甲胺磷和氧樂(lè)果的回收率低于復(fù)水量15、20 mL外,其它化合物的回收率范圍為64%～119%,從整體回收率水平來(lái)看,復(fù)水量10、15、20 mL的平均回收率為87.7%、61.9%、61.2%,可能是由于復(fù)水量太大,枸杞中的一部分糖類物質(zhì)溶入水中進(jìn)而影響凈化效果,使得回收率降低。因此,本實(shí)驗(yàn)得到最佳的復(fù)水量為10 mL。采用液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定枸杞中農(nóng)藥殘留,梁月香[13]選擇5 g樣品的最佳復(fù)水量為5 mL;GB 23200.11-2016[14]中規(guī)定2 g的加水量為5 mL;本實(shí)驗(yàn)中5 g樣品的最佳復(fù)水量是10 mL,可見(jiàn),最佳復(fù)水量的選擇可能與供試樣品的干燥程度、含糖量等因素有關(guān)。

圖3 不同復(fù)水量對(duì)44種農(nóng)藥化合物的提取效果的影響Fig.3 Effect of different water addition on the extraction efficiency of 44 kinds of pesticide compounds

2.4 提取劑的優(yōu)化

選取乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、乙酸乙酯為提取劑,通過(guò)比較目標(biāo)化合物的回收率確定最佳提取溶劑(圖4)。結(jié)果顯示,乙酸乙酯對(duì)各種化合物的提取回收率在50%左右,提取效果較低。比較乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈提取劑對(duì)目標(biāo)化合物的回收率發(fā)現(xiàn):3種條件下甲基硫菌靈、氧樂(lè)果和氟苯脲的回收率均偏低。與乙腈和0.1%乙酸-乙腈相比,0.1%甲酸-乙腈條件下上述化合物的提取回收率較好,且其它化合物的回收率均在60%～120%之間。乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈提取條件下的平均回收率分別為87.79%、88.97%、86.49%,因此,本實(shí)驗(yàn)選取的最佳提取溶劑為0.1%甲酸-乙腈。

圖4 不同提取劑對(duì)44種農(nóng)藥化合物的提取效果的影響Fig.4 Effect of different solvent on the extraction efficiency of 44 kinds of pesticide compounds

2.5 凈化條件的優(yōu)化

以3種不同填料和配比的QuEChERS凈化管為凈化方案(A:PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg,B:PSA 150 mg、GCB 15 mg、MgSO4885 mg,C:PSA 150 mg、GCB 45 mg、MgSO4855 mg)對(duì)44種農(nóng)藥提取液進(jìn)行凈化處理,通過(guò)比較化合物的回收率確定最佳凈化方案(圖5)。從圖5可以看出,方案C中各個(gè)化合物的回收率不均衡,除了甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂(lè)果、霜霉威的回收率達(dá)到80%以上,其它化合物的回收率均較低,無(wú)法達(dá)到試驗(yàn)要求。方案A和B各個(gè)化合物的回收率均在60%～118%之間,平均回收率分別為87.4%和84.5%,均能滿足試驗(yàn)要求。PSA主要用于除樣品中的極性有機(jī)酸和糖類,C18主要用于除去樣品中的油脂和類胡蘿卜素,GCB主要去除葉綠素等色素,且在萃取極性化合物的回收率較C18更高更穩(wěn)定[15],方案B中甲胺磷、乙酰甲胺磷等極性化合物的回收率分別為69.8%、80.7%,較方案A的68.7%和79.3%略高;而其余化合物的回收率均低于方案A。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)以方案A的填料和配比為凈化條件。

圖5 不同凈化條件對(duì)44種農(nóng)藥化合物凈化效果的影響Fig.5 Effect of different purification conditions on the extraction efficiency of 44 kinds of pesticide compounds

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的影響

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定農(nóng)藥殘留常常會(huì)受到樣品基質(zhì)的干擾,本文將枸杞基質(zhì)溶液和乙腈水溶液分別制備成0.02、0.08、0.16 μg/mL的基質(zhì)標(biāo)樣和溶劑標(biāo)樣,以基質(zhì)標(biāo)樣的響應(yīng)與溶劑標(biāo)樣響應(yīng)的比值得到基質(zhì)效應(yīng)(ME)。當(dāng)ME>1時(shí),說(shuō)明基質(zhì)的存在增強(qiáng)了分析物的響應(yīng);當(dāng)ME<1,則基質(zhì)的存在抑制了分析物的響應(yīng);當(dāng)ME=1,表示不存在基質(zhì)效應(yīng)[16]。結(jié)果表明,多數(shù)農(nóng)藥呈基質(zhì)減弱效應(yīng),濃度越低,基質(zhì)減弱效應(yīng)越明顯,尤其是極性強(qiáng)的部分農(nóng)藥,當(dāng)濃度為0.02 μg/mL時(shí),甲胺磷、噻蟲(chóng)嗪和吡蟲(chóng)啉的基質(zhì)效應(yīng)為0.75～0.87,其它化合物的基質(zhì)效應(yīng)不太明顯,在0.90～1.01之間。隨著農(nóng)藥濃度的升高,部分農(nóng)藥反而呈現(xiàn)輕微的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此,在今后的枸杞農(nóng)藥殘留檢測(cè)中,對(duì)于那些基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)的農(nóng)藥,建議最好選擇基質(zhì)匹配標(biāo)曲法進(jìn)行定量分析[17],對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)不明顯的農(nóng)藥,可以用溶劑標(biāo)曲法定量分析。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 線性方程及檢出限、定量限 44種農(nóng)藥在0.002～0.200 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2>0.9943),以儀器的3倍和10倍信噪比(S/N)表示方法的檢出限和定量限,分別為0.01～3.30和0.03～11.0 μg/kg,均能滿足農(nóng)藥殘留分析要求。

表3 44種農(nóng)藥化合物的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 3 Linear relationship,LODs and LOQs for 44 kinds of pesticide compounds

2.7.2 回收率及重復(fù)性試驗(yàn) 在枸杞空白樣品中分別添加低、中、高(0.04、0.08、0.16 mg/kg)3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn),每個(gè)濃度3次平行實(shí)驗(yàn),低、中濃度每個(gè)平行重復(fù)測(cè)定3次,高濃度平行測(cè)定6次,各個(gè)化合物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示,44種農(nóng)藥的回收率范圍為60.2%～115.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%～8.27%。部分檢驗(yàn)項(xiàng)目的回收率偏低,可能是枸杞基質(zhì)效應(yīng)的影響、農(nóng)藥自身極性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)、混標(biāo)溶液間存在的干擾等多方面因素造成。

表4 44種農(nóng)藥的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Average recoveries and RSDs of 44 kinds of pestcides

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

在市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)樣品20批,共檢出農(nóng)藥14種(見(jiàn)表5)。其中多菌靈、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉的檢出率較高,均達(dá)到95%以上;烯酰嗎啉和四螨嗪的檢出率次之,分別為75%和60%。

從測(cè)定結(jié)果還可以看出,14種農(nóng)藥的殘留水平值均較低,啶蟲(chóng)脒遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB 2763-2016[18]規(guī)定的最大殘留限量值1 mg/kg。本實(shí)驗(yàn)中檢出率高的三種農(nóng)藥,與王瑩[19]和蔣玉寶[20]報(bào)道的結(jié)果相一致。

表5 實(shí)際樣品的測(cè)定Table 5 Determination of actual samples

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸-乙腈提取,PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg分散固相萃取凈化,經(jīng)T3色譜柱分離,0.1%甲酸水和乙腈流動(dòng)相體系梯度洗脫,采用電噴霧的動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè),基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的外標(biāo)法定量,建立了同時(shí)測(cè)定枸杞中44種農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析檢測(cè)方法。結(jié)果表明,各農(nóng)藥在濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,決定系數(shù)均大于等于0.9943,三個(gè)添加水平的回收率范圍為60.2%～115.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%～8.27%,檢出限范圍為0.01～3.30 μg/kg。本方法操作簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度和精密度高,適合枸杞中多種農(nóng)藥殘留的定性和定量檢測(cè),可為農(nóng)藥殘留的監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了一種快速高效的分析手段。