釀酒酵母抗鎘基因CAD1的克隆和分析

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(1.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室,云南昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室,云南昆明 650224)

在自然環(huán)境的脅迫下,生物難以維持體內(nèi)的平衡,甚至可能改變細胞功能和阻礙細胞生長[1]。因此面對環(huán)境的脅迫,生物體適應(yīng)脅迫的能力是其生存和進化的先決條件[2]。真核細胞已經(jīng)形成了應(yīng)對機制來對抗各種壓力條件的有害影響,從酵母到人類生物體中的壓力對抗機制是相似的[3]。當釀酒酵母處于惡劣環(huán)境中時,會迅速做出反應(yīng),細胞可通過協(xié)調(diào)各執(zhí)行特定功能的轉(zhuǎn)錄因子維持其穩(wěn)態(tài)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對多種壓力均具有反應(yīng)機制,通過高度協(xié)調(diào)的基因表達保持其體內(nèi)平衡[4]。在面臨環(huán)境脅迫時,釀酒酵母具有復(fù)雜且非常靈活的基因表達程序,被認為是應(yīng)激反應(yīng)機制研究中的模式生物。

目前銅、鐵、鋅等重金屬處于適宜濃度時對人體健康起著重要作用,但高濃度具有極大的毒性,是威脅人類健康的最大風(fēng)險之一[4]。而鎘(Cd2+)和汞(Hg2+)是非必需的金屬,即使在低濃度下也會對人體造成嚴重的損害[5]。鎘毒性涉及胃腸道、肺、腎和骨等器官以及肺和神經(jīng)系統(tǒng)[6]。進入人體的鎘,誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)細胞凋亡[7];在體內(nèi)形成鎘硫蛋白復(fù)合物的形式存在于血液中,通過血液到達全身導(dǎo)致這些器官壞死并最終導(dǎo)致死亡[8];鎘也與鈣通道和含鈣蛋白質(zhì)結(jié)合[9];并且在鎘濃度相當情況下,鎘有很強的誘變作用[9]。由于其強烈的致突變潛力,鎘和鎘的化合物被世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究機構(gòu)歸類為人類致癌物[10]。

釀酒酵母CAD1基因又名YAP2,由于在細胞中過表達該基因獲得了鎘抗性而被命名為CAD1,所編碼的蛋白是真核細胞中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一堿性亮氨酸拉鏈(bZip)蛋白的YAP(“Yeast Activactor Protein”)家族中第二名成員,被廣泛用作模型生物來研究鎘毒性和解毒的分子機制[11]。該基因過表達時可賦予菌株對壓力因子如鎘[12]、黃嘌呤[13]和1,10-菲咯啉[14]等的抗性,說明該基因在對這些有毒物引起的應(yīng)激反應(yīng)中能起作用。但該蛋白質(zhì)的確切作用仍不清楚,仍有待探究。本研究克隆了釀酒酵母CAD1基因,并對其結(jié)構(gòu)和功能進行分析,為后期分析利用該基因用于重金屬鎘的解毒作用及其他有毒物質(zhì)的抗性研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母菌株BZL06 從香格里拉縣奔子欄鄉(xiāng)葡萄皮上分離并鑒定得到的;酵母膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖、TIANamp Yeast DNA Kit、RNase A、Lyticase、山梨醇、DNA Buffer 莊盟生物有限公司;核酸染料 Bioteke Corporation;100 bp DNA Marker Biomed公司;Taq酶、d NTP NEB北京分公司;酵母基因組DNA提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司;引物 生物工程上海股份有限公司。

Eppendorf低溫高速離心機、DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司;SANYO低溫冰箱、Haier冰箱、Y-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海琪特分析儀器有限公司;移液槍 德國Eppendorf公司;Biochrom紫外分光光度計、紫外凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)、Biometra梯度PCR儀、TOMY高壓滅菌鍋、Bio-RAD普通PCR儀、Eppendorf微量移液器、TDA溫度控制儀、SW-CJ-1D潔凈工作臺 江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠;超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo,Nanodrop 2000)、G-BOXF3核酸凝膠成像系統(tǒng) 基因有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀酒酵母基因組DNA的獲得 利用酵母基因組DNA提取試劑盒提取高質(zhì)量的樣品DNA,溶于1×TE緩沖液,并用超微量核酸蛋白檢測儀檢測樣品DNA的濃度[15]。DNA 產(chǎn)物濃度在300 ng/μL左右,OD260/OD280比值為1.87,保存于-20 ℃低溫冰箱中。

1.2.2 釀酒酵母CAD1基因的獲得 使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物,上游引物為ATGGGCAATA TCCTTCGGAAA,下游引物為CTACAGGAGCTGTC TAACCA。PCR反應(yīng)體系:7.7 μL dd H2O,1 μL 10×PCR Buffer,0.8 μL dNTPs,正反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL,1 μL DNA,0.1 μL Taq酶(高保真)。PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性,溫度94 ℃,時長2 min,循環(huán)1次;變性,溫度94 ℃,時長30 s,循環(huán)35次;退火,溫度55 ℃,時長30 s,循環(huán)35次;延伸,溫度72 ℃,時長1 min,循環(huán)35次;再延伸,溫度72 ℃,時長5 min,循環(huán)1次,溫度4 ℃保存樣品。最終產(chǎn)物保存在-20 ℃的低溫冰箱中[16]。

1.2.3 釀酒酵母CAD1基因染色體定位 PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后,直接送2個擴增樣品至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序采用正反向測序,并利用config軟件進行處理,以保證其正確性。再通過NCBI功能基因數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/852033)獲得釀酒酵母CAD1基因的基本信息、定位信息和基因結(jié)構(gòu)。

1.2.4CAD1基因的親緣關(guān)系分析 將已獲得的CAD1堿基序列翻譯為氨基酸序列利用NCBI網(wǎng)站的Open Reading Frame Finder(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/)完成。再將所得到的氨基酸序列導(dǎo)入NCBI-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)的BLAST獲得同源性較高的9條氨基酸序列,進行建樹,分析親緣關(guān)系。建樹首先使用ClustalW2對蛋白序列進行多序列比對,再導(dǎo)入Mega6.0(http://www.megasoftware.net/history.php)中,根據(jù)NJ方法進行構(gòu)樹分析[17]。

1.2.5 釀酒酵母CAD1基因的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析

1.2.5.1 理化性質(zhì)分析 理化性質(zhì)分析使用ExPASy ProtParam(http://us.expasy.org/tools/protparam. html)。

1.2.5.2 親/疏水性分析 親疏水性分析使用ProtScale(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale. pl)。

1.2.5.3 信號肽(signal peptide)預(yù)測 信號肽預(yù)測使用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。

1.2.5.4 亞細胞定位預(yù)測 亞細胞定位預(yù)測使用PSORT(http://psort.nibb.ac.jp)。

1.2.6 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

1.2.6.1 Coil區(qū)分析 Coil區(qū)分析使用COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)。

1.2.6.2 跨膜區(qū)分析 跨膜區(qū)分析使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)。

圖2 由CAD1編碼的蛋白質(zhì)序列Fig.2 Protein sequence encoded by CAD1

1.2.6.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)。

1.2.7 釀酒酵母CAD1基因的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域預(yù)測CAD1基因所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域預(yù)測利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search. html),結(jié)果使用在線工具PROSITE(https://prosite.expasy.org/mydomains)生成圖像。

1.2.8 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 釀酒酵母CAD1基因的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用同源建模的在線分析工具Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)。

1.2.9 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質(zhì)的蛋白互作分析 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質(zhì)的蛋白互作分析使用STRING(http://string_db.org/)在線數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAD1基因擴增結(jié)果和分析

PCR擴增電泳檢測結(jié)果如圖1所示,最左邊為Marker:自下至上分別為100、250、500、750、1000、2000 bp,擴增產(chǎn)物。被檢測基因大小為1200 bp左右,與后期測序所得結(jié)果相符,初步認定所擴增的產(chǎn)物為目的基因。

圖1 CAD1基因PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR test results of CAD1 gene注:M為100 bp DNA Marker;1,空白對照;2和3均為BZL06的CAD1基因PCR擴增產(chǎn)物。

2.2 釀酒酵母CAD1基因染色體定位

在NCBI功能基因數(shù)據(jù)庫的查詢結(jié)果中得到:釀酒酵母CAD1又稱YAP2,蛋白名稱Cad1p,外顯子數(shù):1,全長1230 bp,基因組序列:NC_001136.10,基因編號852033,染色體位置位于Ⅳ染色體1318046～1319275。

2.3 CAD1基因的親緣關(guān)系分析

將釀酒酵母CAD1基因的核苷酸序列放入NCBI網(wǎng)站的Open Reading Frame Finder得到所翻譯的蛋白質(zhì)序列。其分析結(jié)果表明,該核苷酸序列含有一個長1230 bp的開放閱讀框,可編碼409個氨基酸。氨基酸序列如圖2所示。

圖3 CAD1基因編碼蛋白親緣關(guān)系分析Fig.3 Evolutionary analysis based on CAD1 protein

將釀酒酵母CAD1基因的氨基酸序列提交到NCBI網(wǎng)站中進行蛋白質(zhì)BLAST。但基因保守性極高,因此選擇同源性較高的幾條與較低的幾條進行親緣關(guān)系分析。這九條蛋白質(zhì)序列進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),進行比對分析親緣性。發(fā)現(xiàn)本研究克隆得到的CAD1基因編碼的蛋白與其他4種釀酒酵母的蛋白聚為一類,與其他蛋白的關(guān)系較遠。并與釀酒酵母CEN.PK113-7D菌株CAD1蛋白(EIW11633.1)同源性99%最為接近,說明本研究克隆序列正確。且99%的同源性說明該CAD1基因與釀酒酵母CAD1編碼的蛋白質(zhì)執(zhí)行的功能相似,即有可能有對壓力因子如鎘、黃嘌呤和1,10-菲咯啉等的抗性,具有提示這些有毒物引起的應(yīng)激反應(yīng)中起作用的功能。

2.4 釀酒酵母CAD1基因的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 理化性質(zhì)分析 將CAD1基因的氨基酸序列提交到ExPASy ProtParam工具中,從分析結(jié)果中,可知CAD1的蛋白質(zhì)分子式為C1964H3209N573O642S20,包含6408個原子,其分子質(zhì)量為45762.74;氨基酸數(shù)409個,理論等電點pI為6.73;在組成CAD1蛋白的20種氨基酸中亮氨酸的含量最高為9.5%,色氨酸的含量最低為0.7%,不含不常見的氨基酸吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸;不穩(wěn)定指數(shù)51.00,為一個不穩(wěn)定蛋白質(zhì);脂溶指數(shù)80.17,平均親水系數(shù)-0.645。

2.4.2 親/疏水性分析 將CAD1基因的氨基酸序列提交到ProtScale工具中分析該蛋白的親/疏水性,窗口大小調(diào)整為19,圖形輸出如圖4所示。由圖像結(jié)果可知,不存在高分值峰(Scare>1.5),因此該蛋白可能不存在潛在的跨膜區(qū),最高峰值0.921位于點282。而5個低分值峰(Scare<0)位于33、44、55、129、241這些氨基酸位點附近,這些區(qū)域?qū)俑哂H水性[18],最低峰值-2.132位于點44、45。從整個圖分析,負值的比重遠大于正值,這與理化性質(zhì)分析結(jié)果中,平均親水系數(shù)-0.645結(jié)果相符。根據(jù)20種氨基酸疏水特性的參數(shù),較高正值的氨基酸具有較強的疏水性,而較低負值的氨基酸具有較強的親水性[19],因此推斷CAD1所編碼的蛋白為親水性蛋白。

圖4 CAD1基因編碼的蛋白質(zhì)的親疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity analysis of proteins encoded by the CAD1 gene

2.4.3 信號肽預(yù)測 信號肽通常位于分泌蛋白N端,起到引導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移到特定亞細胞結(jié)構(gòu)或分泌至胞外的作用,一般以某種分泌蛋白、細胞膜蛋白等形式存在,由16～30個氨基酸組成[18]。由親疏水性和跨膜區(qū)分析顯示該蛋白為親水蛋白,因此該蛋白應(yīng)不含信號肽。將CAD1基因的氨基酸序列提交到SignalP3.0在線軟件工具中進行分析,結(jié)果如圖5所示,得出結(jié)果該蛋白為非分泌蛋白,存在信號肽概率為0%。

圖5 CAD1蛋白信號肽預(yù)測Fig.5 CAD1 protein signal peptide prediction注:S值:信號肽的分值;Y值:綜合剪切位點的分值;C值:原始剪切位點的分值。

2.4.4 亞細胞定位預(yù)測 蛋白質(zhì)的功能與亞細胞定位關(guān)系密切,將CAD1基因的氨基酸序列提交到SPROT在線軟件工具中進行該蛋白的信號肽預(yù)測。結(jié)果表明位于細胞核的可能性為0.87,位于過氧化物酶體中的可能性為4.3%,位于細胞質(zhì)中的可能性為4.3%,位于細胞骨架中的可能性為4.3%。因此該蛋白極有可能是定位于細胞核中進行代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。

2.5 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5.1 Coil區(qū)分析 卷曲螺旋是蛋白質(zhì)中由兩條及兩條以上的α螺旋鏈互相纏繞形成類似麻花狀結(jié)構(gòu)的超螺旋結(jié)構(gòu)的總稱[18]。主要是一些轉(zhuǎn)錄因子、骨架蛋白、動力蛋白等含卷曲結(jié)構(gòu),在機體內(nèi)執(zhí)行分子識別、代謝調(diào)控、細胞分化等生物學(xué)功能[15]。利用COILS在線分析工具,進行該蛋白質(zhì)的Coil區(qū)分析,結(jié)果如圖6所示,該蛋白質(zhì)殘基在50～150區(qū)域內(nèi),3個不同窗口(Window 14、21、28)均顯示卷曲螺旋。

圖6 CAD1基因編碼蛋白質(zhì)Coil區(qū)分析Fig.6 CAD1 gene encoding protein Coil differentiation

2.5.2 跨膜結(jié)構(gòu)分析 跨膜結(jié)構(gòu)一般由10～20個疏水性氨基酸殘基構(gòu)成并形成α螺旋結(jié)構(gòu),進而可以與膜脂緊密結(jié)合,最終展示為跨膜蛋白的效應(yīng)區(qū)[20]。將CAD1基因的氨基酸序列提交到TMHMM Server v.2.0在線軟件工具中分析該蛋白質(zhì)的跨膜螺結(jié)構(gòu)。輸出圖像如圖7所能作為膜受體起作用也可能是定位在膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白[21],均不溶于水,所以該預(yù)測蛋白質(zhì)為水溶性蛋白。這些均與親疏水性的分析中的推測結(jié)果相符[16]。

圖7 CAD1基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析Fig.7 Transmembrane region analysis of the protein encoded by CAD1 gene注:圖中從上至下的橫線分別表示:outside(膜外)、 transmembrance(跨膜)、inside(膜內(nèi))。

2.5.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象,主要有α-螺旋(α-helix)、β-折疊(β-sheet)、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲(coil)及模體(motif)等組件構(gòu)成[21]。將CAD1基因的氨基酸序列提交到在線分析工具SPOMA中預(yù)測該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),輸出預(yù)測結(jié)果如圖8所示,統(tǒng)計結(jié)果見表1。

圖8 CAD1基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Prediction of secondary structure of protein encoded by CAD1 gene

結(jié)構(gòu)分類個數(shù)占比(%)Alpha helix(Hh)18745.72Extended strand(Ee)368.8Beta turn(Tt)153.67Random coil(Cc)17141.81

預(yù)測結(jié)果中α-螺旋占45.72%,延伸鏈占8.80%,β-轉(zhuǎn)角占3.67%,隨機卷曲占41.81%。由此可見,在CAD1所編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)中,主要存在α-螺旋和隨機卷曲,β-轉(zhuǎn)角與延伸鏈分散分布其中。

2.6 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

結(jié)構(gòu)域是在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中介于二級和三級結(jié)構(gòu)之間的可以明顯區(qū)分但又相對獨立的折疊單元,每個結(jié)構(gòu)域自身形成緊實的三維結(jié)構(gòu),可以獨立存在或折疊[15]。將CAD1基因的氨基酸序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中的Conserved Domains中。預(yù)測得到4個相關(guān)結(jié)構(gòu),結(jié)果如表2所示,得到的結(jié)果在PROSITE中生成圖像如圖9所示。其中,bZIP_YAP為酵母活化蛋白(YAP)和類似蛋白質(zhì)的基本亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域;BRLZ為基本區(qū)域亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)域;PAP1為轉(zhuǎn)錄因子Pap1調(diào)節(jié)抗氧化劑基因轉(zhuǎn)錄以響應(yīng)H2O2,該區(qū)域富含半胱氨酸,用半胱氨酸烷化劑處理后半胱氨酸殘基的烷基化可掩蓋核輸出蛋白Crm1的可及性,引發(fā)核積累和Pap1依賴性轉(zhuǎn)錄表達[22];bZIP_1為bZIP轉(zhuǎn)錄因子Pfam條目包括基本區(qū)域和亮氨酸拉鏈區(qū)域的結(jié)構(gòu)域。

表2 CAD1編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Table 2 Domain prediction of CAD1 encoded proteins

圖9 CAD1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.9 Domain prediction of the protein encoded by CAD1 gene

2.7 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

三級結(jié)構(gòu)是指有特定生物活性、能執(zhí)行生物的催化功能,并發(fā)生充分折疊的完整的三維立結(jié)構(gòu)[23]。利用Swiss-Model進行蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)預(yù)測分析,結(jié)果如圖10所示。

圖10 CAD1基因編碼蛋白質(zhì)的三級空間結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Three-level spatial structure prediction of the protein encoded by CAD1 gene

2.8 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質(zhì)的蛋白互作分析

蛋白互作分析有助于研究基因的功能,上游調(diào)控因子,下游靶向蛋白,形成復(fù)合體發(fā)揮功能等。將CAD1基因的氨基酸序列提交到STRING在線數(shù)據(jù)庫進行分析,選擇蛋白序列分析。選擇僅顯示一級互作且相關(guān)性0.7及以上的分析結(jié)果,如圖11所示。互作相關(guān)性0.7以上的蛋白有9個,其中互作相關(guān)性為0.937的SKN7蛋白是CAD1蛋白最好的功能合作伙伴。SKN7蛋白為核反應(yīng)調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子,與Tup1-Cyc8復(fù)合物物理相互作用并將Tup1p募集到其靶標;分支雙組分信號系統(tǒng)的一部分,最佳誘導(dǎo)熱休克基因所需的響應(yīng)/干擾應(yīng)激、滲透調(diào)節(jié);轉(zhuǎn)錄因子是SLN1-YPD1-SKN7雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一部分,其控制基因表達以響應(yīng)細胞外環(huán)境的滲透壓的變化。在低滲透條件下,被磷酸化中間體蛋白磷酸化和活化[24]。

圖11 CAD1基因編碼蛋白質(zhì)的蛋白互作分析Fig.11 Protein interaction analysis of CAD1 gene-encoded proteins

3 討論與結(jié)論

釀酒酵母在面臨環(huán)境脅迫時擁有非常靈活和復(fù)雜的基因表達程序。酵母細胞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)是通過高度協(xié)調(diào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制實現(xiàn)的,涉及多種轉(zhuǎn)錄因子,每種轉(zhuǎn)錄因子單獨或組合以完成特定功能[4]。特定的應(yīng)激形式,大致可以分為三大類:一是熱休克和某些形式的氧化應(yīng)激,需要激活熱休克因子(HSF),由α-螺旋類DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD),三聚化所需的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和C末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[25]。二是環(huán)境應(yīng)激反應(yīng),HSF非依賴性機制主要由兩個鋅指轉(zhuǎn)錄因子Msn2和Msn4介導(dǎo)[2]。另一個與HSF無關(guān)的機制是由bZIP轉(zhuǎn)錄因子Yap家族發(fā)揮的作用。在釀酒酵母含有的14種bZip蛋白中,有8種是Yap(Yap1-Yap8),形成酵母激活蛋白(Yap)bZIP蛋白家族[26]。這個家族的所有成員都有其關(guān)鍵殘基,賦予這些因素不同的DNA結(jié)合特性[4]。

CAD1基因編碼的蛋白質(zhì)為Yap家族的第二成員Yap2p,在細胞核中進行代謝調(diào)控的不穩(wěn)定的親水蛋白;存在明顯的卷曲螺旋區(qū)域,不存在跨膜結(jié)構(gòu),二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中,α-螺旋和隨機卷曲是主要元件,β-轉(zhuǎn)角與延伸鏈分散在蛋白中;最為主要的結(jié)構(gòu)域為亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域與PAP1結(jié)構(gòu)域,bZIP結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)基序包含堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈,其穩(wěn)定具有平行亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的二聚化。亮氨酸拉鏈的二聚化產(chǎn)生一對相鄰的基本區(qū)域,結(jié)合DNA并產(chǎn)生構(gòu)象變化。二聚化以特定且可預(yù)測的方式發(fā)生,導(dǎo)致數(shù)百個二聚體對轉(zhuǎn)錄具有獨特的作用使其在重金屬鎘與其他有毒物的過表達中存在抗性的表達緊密相關(guān)。PAP1區(qū)域富含半胱氨酸,在Azevedo等[27]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域中含有大量半胱氨酸殘基,鎘可直接與結(jié)構(gòu)域中的殘基結(jié)合,產(chǎn)生半胱氨酸衍生化。Cd與這些殘基的結(jié)合消除了輸出蛋白Crm1對Cad1p核輸出的識別。在由鎘引起的脅迫下,Cad1p通過Crm1在細胞核中積累,在那里它激活FRM2基因的轉(zhuǎn)錄。Fmr2p是一種與硝基還原酶同源的蛋白質(zhì),其在Cd2+和其他有毒物的抗性作用尚不清楚[14]。鑒于通過Reiser等[28]的研究,已知鎘是通過促進脂質(zhì)過氧化級聯(lián)來發(fā)揮其毒性的,因此Cad1p可能是響應(yīng)鎘而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,同時FRM2參與脂肪酸信號傳導(dǎo)。在Rodrigues-Pousada等[29]在研究酵母激活蛋白和應(yīng)激反應(yīng)中,發(fā)現(xiàn)Cad1p的末端富含兩個半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域c-CRD和n-CRD區(qū),在用鎘處理后結(jié)構(gòu)域便會被激活,響應(yīng)表達。Cohen等[30]利用微陣列分析表明,Cad1p可能調(diào)節(jié)一組基因,這些基因編碼在氧化環(huán)境中相互作用并參與穩(wěn)定和折疊蛋白質(zhì)。此外,SKN7蛋白與CAD1蛋白的蛋白互作系數(shù)為0.937,是與其功能表達關(guān)系最為密切的蛋白。SKN7蛋白為核反應(yīng)調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子,與CAD1蛋白在逆境條件下相互作用,可增強其抗性[31]。

目前為止,CAD1的功能仍未明確,但了解這些轉(zhuǎn)錄因子作用的復(fù)雜性以及其過程,對于闡明真核生物中保守的應(yīng)激反應(yīng)機理是非常重要的。本研究克隆了釀酒酵母CAD1基因,并利用生物信息學(xué)的方法對其結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測分析,我們對其結(jié)構(gòu)和應(yīng)激反應(yīng)機理有了更為全面的了解,為今后的鎘抗性研究奠定了一定的基礎(chǔ)。后期分析利用該基因用于重金屬鎘的解毒作用及其他有毒物質(zhì)的抗性研究打下基礎(chǔ)。