高脂飲食對(duì)不同性別小鼠腸道菌群的影響

,*,*

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006;2.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院,廣東廣州 510006)

腸道微生物作為“人類第二基因組”[1],數(shù)量龐大、種類繁多,且不同種類的腸道微生物相互作用,可共同調(diào)控宿主的免疫功能,維持宿主腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2]。人類和小鼠腸道微生物組成相似,主要分為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門及變形菌門等[3]。正常情況下,腸道微生物與宿主及外部環(huán)境處于平衡狀態(tài),并在能量調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)吸收和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用[4],一旦平衡遭到破壞,引起腸道菌群失調(diào),將導(dǎo)致宿主代謝紊亂,對(duì)宿主健康造成威脅。因此,了解腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)及其變化,對(duì)于維護(hù)宿主健康及疾病預(yù)防至關(guān)重要。

眾所周知,膳食結(jié)構(gòu)[5]、遺傳因素[6]、分娩方式[7]、哺乳方式[8-9]、抗生素和藥物的使用[10-11]等都會(huì)影響腸道微生物的組成,其中膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的24 h內(nèi),腸道微生物的組成就會(huì)發(fā)生明顯變化[12]。研究人員對(duì)89種近交系小鼠的腸道微生物進(jìn)行了獨(dú)立分析,發(fā)現(xiàn)各品系小鼠的腸道微生物組成和多樣性均有明顯的差異,雖然性別對(duì)腸道微生物的影響不及宿主基因型[13],但提供了性別影響腸道微生物組成差異的指示性證據(jù)。另外,一項(xiàng)對(duì)75名男性和絕經(jīng)后女性的腸道菌群的研究表明,在不考慮身體質(zhì)量指數(shù)的情況下,微生物群落多樣性和總體組成沒(méi)有顯著性差異[14]。然而另一項(xiàng)對(duì)1135名男性和女性的研究中,不同性別人群腸道微生物的組成有顯著差異[15]?？傊?對(duì)動(dòng)物和人類的研究均表明,性別也是影響腸道微生物的重要因素[13,16]。

近年來(lái),隨著生活水平的不斷提高,人類的飲食習(xí)慣越來(lái)越趨向于“西方化”的高脂、高糖膳食。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,飲食結(jié)構(gòu)與宿主性別共同作用,影響腸道微生物的組成[17]。而高脂飲食誘導(dǎo)雌性和雄性宿主腸道微生物的變化情況或趨勢(shì)是否一致尚不明確[18]。因此,為了研究高脂飲食對(duì)雌性和雄性小鼠腸道微生物組成結(jié)構(gòu)的影響,以不同性別的C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象,分別用基礎(chǔ)飼料和高脂飼料飼喂,飲食干預(yù)6周后收集小鼠的新鮮糞便,對(duì)小鼠糞便細(xì)菌16S-rDNA的V3+V4區(qū)域進(jìn)行測(cè)序,分析比較雌性和雄性小鼠腸道微生物菌群的組成結(jié)構(gòu),探討高脂飲食對(duì)不同性別小鼠腸道微生物的影響,為深入研究飲食及性別因素對(duì)腸道微生物的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只6周齡SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0008),雌雄各半,體重15～18 g,購(gòu)自南京大學(xué)動(dòng)物模式研究所;基礎(chǔ)飼料(舒克貝塔1010013) 江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司;45%高脂飼料(Research Diets,D12451) 北京凱國(guó)科技有限公司;飼料主要物質(zhì)供能比見(jiàn)表1;E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒 美國(guó)Omega Bio-Tek公司;瓊脂糖粉末 北京沃比森科技公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國(guó)Axygen Biosciences公司;引物341F/806R 生工生物公司合成;KOD Buffer/dNTPs/KOD聚合酶 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

表1 飼料主要物質(zhì)供能表Table 1 Energy supplyTable of main materials of feed

微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司;普通PCR儀 美國(guó)Bio-rad公司;電泳儀 美國(guó)Bio-rad公司;液氮罐 美國(guó)Thermo公司;凝膠成像儀 美國(guó)Bio-rad公司;QuantiFluor-ST熒光計(jì) 美國(guó)Promega公司;低溫臺(tái)式高性能離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;Milli-Q純水儀 美國(guó)Millipore公司;超低溫冰箱 長(zhǎng)虹美菱股份有限公司;全自動(dòng)雪花制冰機(jī) 南京先歐科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 C57BL/6J小鼠按雌雄各隨機(jī)分為對(duì)照組(F-CON&M-CON)和高脂組(F-HF&M-HF),每組4只小鼠,基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d后,分別飼喂基礎(chǔ)飼料(CON)和45%高脂飼料(HF),飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替,控制室內(nèi)溫度在22～25 ℃,濕度在55%～65%,食物和水自由攝取。

1.2.2 樣本采集 飲食干預(yù)六周后,收集每組小鼠新鮮清潔無(wú)污染的糞便樣本,迅速置于液氮中,并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 腸道微生物DNA提取及PCR擴(kuò)增 按照E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒(Omega Biotek,Norcross,GA,U.S.)提取糞便DNA樣品,對(duì)提取后的DNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。然后用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S-rDNA的V3+V4區(qū)域。引物序列為341F:CCTACGGGNGGCWGCAG;806R:GGACTACHVGGGTATCTAAT。擴(kuò)增體系為:5 μL的10×KOD Buffer,5 μL的2.5 mmol/L dNTPs,1.5 μL引物(5 μmol/L),1 μL的KOD聚合酶和100 ng模板DNA,最終體積為50 μL。擴(kuò)增條件如下:95 ℃預(yù)變性2 min,隨后 98 ℃ 變性10 s,62 ℃ 退火30 s,68 ℃延伸30 s,共27個(gè)循環(huán),最后68 ℃延伸10 min。

1.2.4 建庫(kù)和測(cè)序 從2%瓊脂糖凝膠中回收擴(kuò)增產(chǎn)物,用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,GA,U.S.)純化擴(kuò)增產(chǎn)物,再經(jīng)QuantiFluor-ST(Promega,U.S.)熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合,連接測(cè)序接頭,根據(jù)Illumina說(shuō)明構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),以Hiseq2500的PE250模式上機(jī)測(cè)序,將得到的原始Reads存儲(chǔ)到NCBI序列讀存檔(SRA,Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫(kù)中用于后續(xù)分析[19]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用Mothur(v1.39.1)軟件對(duì)tag序列進(jìn)行去冗余處理[20],從中挑選出 unique tag 序列,然后用 Uparse(v9.2.64_i86linux32)軟件對(duì)所有樣品的全部 Effective Tags 序列按97%的相似性聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units),再與RDP(Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),對(duì)OTUs進(jìn)行物種注釋[21]?；贠TU的豐度結(jié)果,利用R語(yǔ)言中的GUniFrac(v1.0)計(jì)算兩兩樣本間的Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離[22],然后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)的主坐標(biāo)分析(PCoA,Principal coordinates analysis)和非加權(quán)組平均聚類分析(UPGMA,Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)圖像分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)的分析結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SED)表示,兩組間的比較采用t檢驗(yàn)(t-test),P<0.05為差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同飲食組小鼠體重和腸道微生物主坐標(biāo)分析Fig.1 The principal coordinates analysis (PCoA)of weight and gut microbiota of different diet groups of mice注:F-CON代表雌性基礎(chǔ)飼料組,F-HF代表雌性高脂組;M-CON代表雄性基礎(chǔ)飼料組,M-HF代表雄性高脂組;不同形狀表示不同的飲食組;n=4,與對(duì)照組相比,* P<0.05,** P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂飲食對(duì)小鼠腸道微生物組成的影響

由圖1A可知,飲食干預(yù)6周后,小鼠體重已有明顯差異,同一性別小鼠,高脂飲食組體重顯著高于基礎(chǔ)飲食組體重(P<0.05)。OTUs主坐標(biāo)分析結(jié)果表明,基礎(chǔ)飲食小鼠和高脂飲食小鼠腸道微生物的數(shù)據(jù)點(diǎn)表現(xiàn)出各自聚集分布的情況,并且膳食因素對(duì)腸道微生物差異的貢獻(xiàn)值達(dá)52.46%(圖1B)。說(shuō)明飲食干預(yù)影響了小鼠腸道微生物組成,這可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及能量代謝水平差異有關(guān)。

2.2 高脂飲食對(duì)小鼠腸道微生物多樣性的影響

由圖2可知,對(duì)照組小鼠和高脂組小鼠腸道微生物以組為單位聚集在同一簇;在對(duì)照組中,雌性小鼠和雄性小鼠腸道微生物各自成簇,高脂組小鼠腸道微生物也基于性別各自成簇,表明性別也是影響腸道微生物多樣性的因素。相同飲食的小鼠之間的共同分支距離更短且空間距離更近,意味著腸道微生物更相似,說(shuō)明高脂飲食改變了雌性和雄性小鼠腸道微生物多樣性,同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了飲食結(jié)構(gòu)和性別是影響腸道微生物多樣性的重要因素。

圖2 不同飲食組小鼠的腸道微生物UPGMA分類樹(shù)Fig.2 The UPGMA cluster dendrogram of gut microbiota of different diet groups of mice注:每個(gè)分支對(duì)應(yīng)一個(gè)樣本,分支距離代表 相似性,距離越短,樣品越相似。

2.3 高脂飲食對(duì)雌性和雄性小鼠腸道微生物菌門組成的影響

在門分類水平上,對(duì)小鼠腸道微生物組成的分析發(fā)現(xiàn),各組小鼠優(yōu)勢(shì)菌均由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門組成。如表2所示,高脂飲食條件下,雌性小鼠變形菌門相對(duì)豐富度為(5.46%±0.55%),顯著低于對(duì)照組(P<0.05);而雄性小鼠變形菌門的相對(duì)豐富度為(7.86%±0.68%),相比于對(duì)照組(3.01%±0.31%)極顯著升高(P<0.01)。另外,高脂飲食條件下,雌性小鼠放線菌門的相對(duì)豐富度(8.57%±1.15%)與對(duì)照組(0.78%±0.07%)相比極顯著升高(P<0.01),而雄性小鼠放線菌門相對(duì)豐富度(2.92%±0.66%)與對(duì)照組(3.99%±2.30%)相比無(wú)顯著下降(P>0.05)。以上數(shù)據(jù)表明高脂飲食對(duì)不同性別小鼠腸道菌群產(chǎn)生不同的影響,推斷不同菌門在宿主體內(nèi)可能有不同的代謝偏好,并且變形菌門對(duì)飲食干預(yù)的反映較為顯著,這也許是由于菌群與性激素水平之間的相互作用,繼而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài),但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

2.4 高脂飲食對(duì)雌性和雄性小鼠腸道微生物菌種組成的影響

由圖3A可知,在種分類水平上各組小鼠腸道微生物都能夠注釋到的物種,主要包括Lactobacillusmurinus、Lachnospiraceaebacterium615、Blautiacoccoides、Leptum、Bacteroidesacidifaciens等菌種。如圖3B所示,高脂飲食干預(yù)下,厚壁菌門分類下的L.murinus菌種在雌性小鼠的相對(duì)豐富度為(3.13%±0.28%),與對(duì)照組(1.55%±0.23%)相比極顯著上升(P<0.01),但該菌種在雄性小鼠中呈相反趨勢(shì),高脂飲食下其相對(duì)豐富度為(1.27%±0.22%),與對(duì)照組(3.88%±1.44%)相比雖無(wú)顯著性差異,但呈下降趨勢(shì),進(jìn)一步證實(shí)高脂飲食干預(yù)下,腸道微生物因宿主性別不同而發(fā)生不同的變化。

表2 門分類水平優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐富度(%)Table 2 The relative abundance of predominate gut microbiota at phylum level(%)

注:與相同性別對(duì)照組相比,*P<0.05;**P<0.01。

圖3 小鼠腸道微生物種水平組成及相對(duì)豐富度Fig.3 The composition and relative abundance of gut microbiota at species level of mice注:與對(duì)照組相比,** P<0.01。

3 討論

本研究使用45% 高脂飼料飼喂8周齡雌性和雄性小鼠,模擬當(dāng)前人類“西方化”的高脂飲食習(xí)慣。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,成人體內(nèi)重要的腸道微生物包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門等[3],本研究結(jié)果顯示,在門分類水平上,所有小鼠的優(yōu)勢(shì)菌門也是由這4大類組成。目前關(guān)于性別對(duì)腸道菌群組成的影響的報(bào)道,結(jié)果不一致[13,17,23-24],考慮是由于飲食、宿主遺傳背景和年齡等因素在一定程度上的影響所致。本研究旨在探討高脂飲食與性別對(duì)腸道微生物的不同影響。顯然,在遺傳背景和年齡相同的情況下,飲食和性別是影響腸道微生物組成的重要因素。Carmody R等[25]對(duì)五種近交系小鼠的研究發(fā)現(xiàn):小鼠的腸道微生物因飲食波動(dòng)呈線性劑量關(guān)系,表明飲食在宿主腸道微生物差異中起到了主導(dǎo)作用,本研究也充分表明了高脂飲食對(duì)腸道微生物菌群的影響顯著(貢獻(xiàn)值達(dá)52.46%)。此外,在高脂飲食條件下,雄性小鼠和雄性小鼠變形菌門出現(xiàn)相反的變化,此種差異可能是由于宿主體內(nèi)激素水平差異引起菌門代謝偏好所致[26]。另有研究表明,肥胖女性體內(nèi)的放線菌門豐富度升高[27],本研究也發(fā)現(xiàn):在高脂飲食條件下,雌性小鼠放線菌門的豐富度顯著升高(P<0.05),但雄性小鼠卻無(wú)顯著變化(P>0.05),這可能與宿主能量吸收及代謝水平有關(guān)[28]。進(jìn)一步分析種分類水平上的菌種差異,發(fā)現(xiàn)在高脂飲食條件下,厚壁菌門下的Lactobacillusmurinus菌種在雌性小鼠中顯著上升(P<0.05),但在雄性小鼠中無(wú)顯著變化(P>0.05),Pan等[29]發(fā)現(xiàn)L.murinus菌種能夠降低無(wú)菌小鼠的腸道通透性和血清內(nèi)毒素水平,從而減輕衰老菌群引起的炎癥反應(yīng),說(shuō)明該菌種具有一定的抗炎作用;另有研究表明L.murinus菌種并不會(huì)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肥胖[30],因此該類菌種與肥胖產(chǎn)生的聯(lián)系需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)了高脂飲食可以改變雌性和雄性小鼠腸道微生態(tài)的結(jié)構(gòu),但對(duì)雌性和雄性小鼠腸道微生物組成及變化的影響并不完全相同,為深入研究飲食及性別因素對(duì)腸道微生物的影響提供依據(jù)。然而,研究結(jié)果并不能解釋這種差異是否與激素水平、能量代謝等因素相關(guān),因此還有待進(jìn)一步研究。