玫瑰紅景天揮發(fā)性成分分析及其抗氧化和抗菌活性

劉存芳,史 娟,劉軍海,張 強,杜全超,王 偉,田光輝

(陜西理工大學陜西省催化基礎與應用重點實驗室,陜西漢中 723000)

玫瑰紅景天(RhodiolaroseaL.)是景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)的一種多年生草本植物,又稱為薔薇紅景天[1],多野生于林地、山坡、干燥的石縫隙、陡巖間等地方[2],分布于我國東北、華北、西北等山區(qū)。明代李時珍在《本草綱目》中記載玫瑰紅景天為“本經上品,祛邪惡氣”,被稱為“仙賜草”,有玫瑰香味,新鮮時更濃郁,全草均可藥食兩用,常用根莖,性“甘、苦,平,歸肺、心經”[3],味微苦、酸澀,其功能主要為活血止血、化瘀消腫、抗炎、抗缺氧、抗疲勞、抗抑郁、抗過敏、抗輻射、抗癌等[4-5],常用于治療嘔血、咳血、高血壓、冠心病等病癥[6],有“扶正固本”的作用[7]。人們對玫瑰紅景天的生物活性以及其活性成分不斷地進行著研究[8-9],紅景天中的活性成分豐富多樣,含有紅景天苷(salidroside)及其苷元酪醇(ptyrosol)、酪薩維(rosavin)、絡塞琳(rosarin)、絡塞(rosin)等[10-11],還含有6′-O-沒食子酰-紅景天苷、對-O-β-吡喃葡萄糖基-苯丙烯酸、7-甲氧基香豆素等多種化合物[12],另有文獻報道采用微波技術從玫瑰紅景天中提取總黃酮和多糖,并對其含量進行測定[13-14]。玫瑰紅景天中揮發(fā)性物質的研究尚少[15-16],對其揮發(fā)性物質的活性研究更少,對紅景天同屬植物如大花紅景天[17]、高山紅景天[18]、小叢紅景天[19]、狹葉紅景天[20]等的揮發(fā)性物質研究較多[21],也有對紅景天屬植物揮發(fā)性物質活性的研究報道[18,20]。紅景天揮發(fā)性物質有諸多特殊的活性如抗菌、抗炎、抗氧化等,可用于醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)等領域,開發(fā)紅景天揮發(fā)性物質前景廣闊。

本研究以玫瑰紅景天為原料,采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性物質,用GC-MS和GC分離定性,進行體外抗氧化和抗菌活性試驗,旨在為綜合利用玫瑰紅景天這一珍稀野生藥食兼用植物資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰紅景天(RhodiolaroseaL.) 2017年11月上旬收集于西藏林芝山區(qū),全草經陜西理工大學省級植物學科負責人趙樺教授鑒定和確認,實驗用其新鮮的根莖;系列正構烷烴物質(C6～C23) 為色譜純，購自北京化學試劑公司(進口分裝);實驗所用其他試劑 均為國產分析純,西安化學試劑廠;肉湯培養(yǎng)基、水解酪蛋白胨(MH)肉湯、普通瓊脂平板培養(yǎng)基等 北京索萊寶科技有限公司;試驗標準菌株凍干品 中國食品藥品檢定研究院中國醫(yī)學細菌保藏管理中心;pH7.4的150 mmoL/L PBS緩沖溶液、濃度為1.5 mmoL/L鄰二氮菲溶液、1.5 mmoL/L硫酸亞鐵溶液、0.02%雙氧水溶液 現用現配;水 為二次蒸餾水。

Finnigan-Trace DSQ氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS) 美國熱電公司,配有DB-5型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);Agilent 6890N氣相色譜儀(GC) 美國安捷倫利科技有限公司,配有HP-5型色譜柱(5% Phenyl Methyl Siloxane,capillary:30.0 m×320 μm×0.25 μm);96孔培養(yǎng)板 美國康寧公司;UV-6300PC紫外可見光光度計 上海美譜達儀器有限公司;普通培養(yǎng)箱 上海風棱實驗設備有限公司;HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;中藥材粉碎機 廣州賽豪機械有限公司;水蒸氣蒸餾裝置、玻璃器皿 天津化?？萍加邢薰?。

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的提取 將玫瑰紅景天的根莖陰干,用粉碎機粉碎,過50目篩,粉末密封保存。稱取100.0 g粉末于蒸餾瓶中加入等質量的水浸泡過夜后安裝水蒸氣蒸餾裝置,提取揮發(fā)性物質8 h,餾出液加入氯化鈉形成飽和溶液再用乙醚萃取三次,合并萃取液加入無水硫酸鈉干燥過夜,在40 ℃水浴中蒸餾回收乙醚[22],得到淡黃色油狀有香味的揮發(fā)性物質1.98 g,得率為1.98 g/100 g。重復提取三次,密封0～5 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氣相色譜-質譜聯用儀工作條件 色譜條件:載氣He氣,柱溫50～280 ℃,初始溫度設定50 ℃,保持3 min后,用程序升溫10 ℃/min,溫度至180 ℃保持4 min,再以10 ℃/min升溫至250 ℃,保持3 min;色質界面溫度250 ℃,衡流模式,進樣量0.5 μL,流量1 mL/min,分流比50∶1。質譜條件:離子源溫度設定250 ℃,電離能量為70 eV,倍增器電壓為978 V,離子源為EI,掃描范圍45～500 m/z。

1.2.3 保留指數的確定 通過GC用系列正構烷烴物質的混合物(C6～C23)來確定揮發(fā)性物質中各個組分的Kovats保留指數RI值[23],GC工作條件同1.2.2中的色譜條件。

1.2.4 對羥基自由基清除率的測定 通過H2O2/Fe2+體系測定清除羥基自由基·OH的效果[24],將玫瑰紅景天揮發(fā)性物質配制成0.1 mg/mL的溶液,取8支10 mL規(guī)格的具塞比色管,逐個移入1 mL鄰二氮菲溶液、3.0 mL PBS溶液,振蕩混勻,再分別加入2 mL硫酸亞鐵溶液,振蕩混勻,在6支比色管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL不同梯度的玫瑰紅景天揮發(fā)性物質溶液,振蕩混勻,編號為1～6號;另外2支比色管標識為損傷管和未損傷管,不加玫瑰紅景天揮發(fā)性物質溶液,1～6號管和損傷管中再分別加入1 mL雙氧水溶液,未損傷管不加雙氧水溶液。在8支比色管中用水定容至10 mL,振蕩混勻,此時1～6號管中玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的濃度分別為0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 mg/mL,放置于普通培養(yǎng)箱中設定溫度為37 ℃保溫反應60 min,取出冷卻至室溫,用分光光度計在510 nm波長下測定8支比色管中溶液的吸光度A。以相同濃度的維生素C作為參照。重復測量三次,取平均值。

·OH的清除率(%)=(A2-A1)/(A0-A1)×100

式中:A0為未損傷溶液的吸光度;A1為損傷溶液的吸光度;A2為加玫瑰紅景天揮發(fā)性物質溶液的吸光度。

1.2.5 抗菌活性試驗 體外抗菌活性的試驗菌株為金黃色葡萄球菌ATTCC25925株、大腸桿菌ATCC25922株、腸炎沙門氏菌50040株、鼠傷寒沙門菌50013株、痢疾志賀氏菌CMCC51105株、福氏志賀氏菌CMCC51572和白色念株菌ATCC10231株,7個標準菌株。

表1 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的化學組分Table 1 Chemical components of the volatile compound form Rhodiola rosea L.

菌液制備:將試驗菌株在MH肉湯中接種后放置于普通培養(yǎng)箱內,控溫37 ℃培養(yǎng)24 h,光電比濁計數法確定細菌的數量。用MH肉湯培養(yǎng)液調制成106CFU/mL,將玫瑰紅景天揮發(fā)性物質溶于含5% Tween-80的肉湯中,連續(xù)二倍梯度稀釋后在96孔培養(yǎng)板以0.2 mL/孔注入不同濃度的玫瑰紅景天揮發(fā)性物質溶液,分別注入濃度為106CFU/mL的實驗菌液50 μL/孔,設置空白對照,在濕盒內放置水平再放進微生物培養(yǎng)箱中控溫37 ℃下培養(yǎng)24 h,觀測,沒有細菌生長孔的最小玫瑰紅景天揮發(fā)性物質溶液的濃度為最小抑菌濃度MIC;在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上采用平板轉種法確定最小殺菌濃度(MBC)[25]。

1.3 數據處理

色譜峰的質譜圖經計算機與NIST譜庫和WILEY譜庫中入庫譜圖進行對比,相似度大于85%予以認定,Kovats保留指數RI值以系列正構烷烴為對照用色譜圖中兩邊相近的正構烷烴進行標定[26],結合文獻數據進行分析來定性確定。將總離子流圖譜經計算機用峰面積歸一化法確定玫瑰紅景天揮發(fā)性物質中各個組分的相對含量。

數據處理和圖形繪制用OriginLab Origin V 8.0軟件。

2 結果與討論

2.1 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質中的組分分析

用GC-MS對玫瑰紅景天揮發(fā)性物質分離的總離子流圖如圖1,檢出55個組分,各組分經質譜掃描所得的質譜圖譜通過計算機自動檢索譜庫,人工解析圖譜將各組分的質譜碎片和文獻對比,結合相對豐度、質荷比和基峰等,對各組分逐一進行確認,從玫瑰紅景天揮發(fā)性物質中鑒定出53種化合物,鑒出化合物的相對含量占到總峰的98.35%,各組分結構確定的結果如表1。表1中保留指數RI值是以系列正構烷烴(C6～C23)作為對照品,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質中的各個組分的出峰時間可用色譜圖上兩邊相近的兩個正構烷烴進行標定,保留值接近,測定的保留指數精確度較高相對偏差在0.1%～0.2%內,采用保留指數RI值能減少外部因素的影響,提高重現性和鑒定的效率。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的組分豐富多樣,以醇、醛、酚、酯和烷烴類為主,還有烯烴、酸、酮、炔、酰胺和黃酮類,其中醇類19種、醛8種,酚、酯和烷烴各5種,烯烴和羧酸各3種、酮2種、炔、酰胺和黃酮類各1種。

圖1 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的GC-MS總離子流圖Fig.1 TIC chromatograms of the volatile compound from Rhodiola rosea L.

續(xù)表

玫瑰紅景天揮發(fā)性物質中的主要組分是1-辛醇(1-Octanol,42.72%)、香葉醇((Z)-3,7-dimethyl-2,6-Octadien-1-ol,29.85%)、苯乙醇(Phenylethyl alcohol,9.67%)、桃金娘烯醇((-)-Myrtenol,2.69%)、芳樟醇(Linalool,1.89%),這5種化合物在玫瑰紅景天揮發(fā)性物質中的含量占到了總量的86.82%,其中1-辛醇和香葉醇的含量就占到了72.57%。1-辛醇有微甜的草香味是GB2760-86中允許使用的食用香料,也是重要的香料中間體,能被氧化成另一種天然產物辛酸[27];香葉醇有玫瑰香味,有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、平喘等廣泛的藥理活性[28];苯乙醇有清甜的玫瑰花香味,也是允許使用的一種天然食用香料,有抗菌、防腐、抑制心房肌肉收縮、抑制平滑肌收縮、緩和高血壓、支氣管平滑肌松弛等作用;桃金娘烯醇有清涼的檀木薄荷香氣,有抗炎、抗氧化作用,能治療急、慢性鼻炎、鼻竇炎以及急、慢性氣管炎和支氣管炎等;芳樟醇呈鈴蘭香味,有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、防止齲齒以及鎮(zhèn)靜等作用,廣泛應用于食品工業(yè)、藥物合成中間體、精細化工等領域,這些較高含量的化合物均含有羥基,含羥基活性基團的化合物往往是極性分子會表現出特殊的生理活性,預示著玫瑰紅景天揮發(fā)性物質有潛在的生物活性。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質中的主要組分和大花紅景天揮發(fā)油主要化學成分為1-辛醇、香葉醇等相似[17],和西藏紅景天揮發(fā)油主要成分為香葉醇、1-辛醇、芳樟醇、甲酸辛酯、桃金娘醇等基本一致[21],和文獻報道的5個種屬12個西藏紅景天樣品分析的結果基本相同[19],但主要化學成分及其含量也都存在著差異,這與品種、采樣季節(jié)和產地有關。

2.2 清除羥基自由基的效果

由圖2可知,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質在相同濃度下和維生素C相比,對H2O2/Fe2+體系中的羥基自由基清除率均要高,說明對羥基自由基表現出明顯的清除效果。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的濃度和清除率存在著量效關系,隨著玫瑰紅景天揮發(fā)性物質濃度的增加對羥基自由基的清除率不斷增強,均高于相同濃度維生素C對羥基自由基的清除率,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質及維生素C的半抑制濃度IC50分別為0.0073 mg/mL和0.0092 mg/mL,說明玫瑰紅景天揮發(fā)性物質有明顯的抗氧化活性,是一種天然的抗氧化物質。

圖2 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對羥基自由基的清除作用Fig.2 Scavenging activity of the volatile compound form Rhodiola rosea L.on ·OH

2.3 抗菌活性

玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對7個標準菌株的MIC和MBC如表2,從表2中結果可以看出,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對試驗所選的7個菌株均有明顯的抑制效果,能抵抗這7個致病菌的侵染。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對金黃色葡萄球菌ATTCC25925和大腸桿菌ATCC25922的MIC值分別是0.12和0.58 mg/mL,說明對這兩個細菌有強烈的抑制作用;玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對腸炎沙門氏菌50040、痢疾志賀氏菌CMCC51105、福氏志賀氏菌CMCC51572和白色念株菌ATCC10231的MIC值在2.02～9.02 mg/mL之間,表明玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對這些細菌也有明顯的抑制作用。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對金黃色葡萄球菌ATTCC25925的MBC值是0.36 mg/mL,表明玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對該細菌有強烈的殺滅作用;對其他6個細菌的MBC值在1.90～11.34 mg/mL之間,說明對這6個細菌也有明顯的殺滅作用。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對金黃色葡萄球菌ATTCC25925和大腸桿菌ATCC25922的抑制作用表現得更為強烈。

表2 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質 對試驗菌株的MIC值和MBC值(mg/mL)Table 2 MIC(mg/mL)and MBC(mg/mL)of the volatile compound form Rhodiola rosea L.on tested strains

3 結論

玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的主要組分有1-辛醇、香葉醇、苯乙醇、桃金娘烯醇、芳樟醇等,醇類19種、醛8種,酚、酯和烷烴各5種,烯烴和羧酸各3種、酮2種,炔、酰胺和黃酮類各1種,組分豐富多樣,與文獻報道的紅景天同屬其他植物揮發(fā)性物質的組分有相似性,一些主要組分是一致的,這說明物種與其化合物組成有相關性,但由于品種、采樣季節(jié)和產地的不同揮發(fā)性物質的組分會存在差異,這意味著揮發(fā)性物質的活性以及活性效果也會不同[22]。通過H2O2/Fe2+體系以維生素C為參照品來考察玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對羥基自由基的清除作用,與維生素C比較對羥基自由基的清除率要高,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質及維生素C的半抑制濃度IC50分別為0.0073和0.0092 mg/mL,表現出明顯的清除作用,對玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的抗氧化活性也進行了初步試驗。體外抗菌測試的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)結果表明,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質對試驗所選的7個菌株均有明顯的抑制效果,能有效地抵抗這7個致病細菌,對金黃色葡萄球菌ATTCC25925和大腸桿菌ATCC25922的抑制作用更為強烈,說明玫瑰紅景天揮發(fā)性物質是一種有待開發(fā)具有抗菌和抗氧化的天然活性物質,由于玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的組分種類豐富多樣,其他抗氧化活性和抗菌活性的試驗仍有研究的價值和意義,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質的抗氧化抗菌的機理以及其他活性試驗還有待進一步研究。