北蟲草小麥培養(yǎng)殘基中蟲草素提取工藝優(yōu)化

宋 潔 劉曉紅

（遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東118003）

北蟲草（Cordyceps militaris）又稱蛹蟲草，屬子囊菌亞門、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬[1]。隨著北蟲草市場需求不斷上升，采收北蟲草子實體后廢棄培養(yǎng)基質(zhì)會越來越多，其中以小麥培養(yǎng)基質(zhì)居多。開發(fā)利用北蟲草廢棄基質(zhì)小麥資源，可以大幅度降低生產(chǎn)成本，并具有一定市場潛力。蟲草素是北蟲草中重要生物活性物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)免疫力[2]、抑菌[3]、抗腫瘤[4-5]等作用。研究表明北蟲草培養(yǎng)殘基中含有蟲草素[6]。響應(yīng)面分析法（responsesurface methodology，RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可以確定試驗考察因素及其之間交互作用在工藝過程中對響應(yīng)值的影響，精確表述考察因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[7，8]。試驗將響應(yīng)面分析方法應(yīng)用于北蟲草小麥培養(yǎng)殘基蟲草素超聲提取工藝優(yōu)化，探究響應(yīng)值（多糖得率）與考察因素之間的數(shù)量關(guān)系，獲得最優(yōu)超聲提取工藝并予以驗證，為北蟲草小麥培養(yǎng)殘基開發(fā)利用提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

北蟲草小麥培養(yǎng)殘基，由遼東生物產(chǎn)業(yè)研究所提供。樣品于50℃烘干打粉，60目過篩備用。蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品鑒定所），甲醇（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

日本島津LC-10Avp高效液相色譜儀，SIL-10AVP自動進樣器，SPD-10Avp紫外檢測器，SCL-10Avp數(shù)據(jù)處理工作站，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 北蟲草小麥培養(yǎng)殘基中蟲草素的提取及測定

準(zhǔn)確稱量北蟲草小麥培養(yǎng)殘基60目干粉5 g，加入適量甲醇超聲提取、離心，取上清100 μL加入超純水定容至1 mL，靜置，得到待測液。

HPLC測定蟲草素含量：色譜柱Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相（甲醇∶水=15∶85），流速1 mL/min，檢測波長260 nm，進樣量10 μL，溫度25℃。

北蟲草殘基中蟲草素提取率的計算公式為：

式中：M1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的被測液中蟲草素的含量（μg），M2為稱取的殘基粉末的質(zhì)量（g），V1為待測液分取的體積（mL），V2為待測液的總體積（mL）[9]，Y為北蟲草殘基中蟲草素提取率。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

超聲時間水平確定：固定超聲提取溫度60℃、提取次數(shù)3次、液（mL）料（g）比20、超聲功率100 W，超聲時間分別為 15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min。

超聲溫度水平確定：固定超聲時間15 min、提取次數(shù)3次、液（mL）料（g）比20、超聲功率100 W，超聲提取溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。

提取次數(shù)水平確定：固定超聲時間15 min、超聲溫度60℃、液（mL）料（g）比20、超聲功率100 W，提取次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次、5次、6次。

液料比例水平確定：固定超聲時間15 min、超聲溫度60℃、提取次數(shù)3次、超聲功率100 W，液（mL）料（g）比分別為10、20、30、40、50、60。

超聲功率水平確定：固定超聲時間15 min、超聲溫度60℃、提取次數(shù)3次、液（mL）料（g）比20，超聲功率分別為40 W、60 W、80 W、100 W、120 W、140 W。

分析上述不同條件下，對北蟲草小麥殘基中蟲草素提取率的影響。按照1.2.1方法獲得蟲草素提取率。

1.2.3 Plackett-Burman試驗設(shè)計

單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Design-Expert.V8.0.6軟件中Plackett-Burman設(shè)計，進行5因素2水平的一階試驗，篩選出對蟲草素提取率具有顯著影響作用的因素。

1.2.4 響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計

基于Plackett-Burman設(shè)計篩選出影響蟲草素提取率的顯著因素，采用Design-Expert.V8.0.6軟件，通過Box-Behnken設(shè)計進行3水平的二階優(yōu)化，獲得最優(yōu)超聲提取北蟲草小麥培養(yǎng)殘基中蟲草素的工藝方法，并進行模擬驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗單因素對小麥培養(yǎng)殘基蟲草素提取率的影響

通過HPLC檢測超聲提取蟲草素在不同超聲時間、不同超聲溫度、不同提取次數(shù)、不同液料比、不同超聲功率條件下，所積峰面積，利用公式計算出不同條件下，北蟲草殘基中蟲草素提取率見圖1（a、b、c、d、e）。

蟲草素提取率隨著超聲提取時間延長而提高，當(dāng)超聲提取時間在45 min時最佳，時間延長對蟲草素提取影響不大（圖1a）；超聲提取溫度過高會破壞蟲草素分子結(jié)構(gòu)，60℃蟲草素提取率最高，超過60℃后提取率降低（圖1b）；提取次數(shù)大于3次，蟲草素提取率基本沒變（圖1c）；提取料液比對蟲草素提取率影響較大，相同北蟲草培養(yǎng)殘基，液（mL）料（g）比在30時，提取率最優(yōu)（圖1 d）。超聲功率大于60 W對蟲草素提取率影響不大，120 W蟲草素提取率最高（圖1e）。

圖1 北蟲草殘基中蟲草素提取率單因素試驗結(jié)果

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果與分析

單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計（N=12）篩選對蟲草素提取率顯著影響因子，并輸入因子超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）、提取次數(shù)（X4）、提取液料比（X5）、超聲功率（X6），X3、X7為虛擬因子，每項均取高（+1）低水平（-1），響應(yīng)值Y為蟲草素提取率（%），具體見表1和表2。

利用Design-Expert.V8.0.6軟件對Plackett-Burman試驗結(jié)果分析。由表3中可以看出，模型具有極顯著性，該模型可以用于北蟲草小麥殘基中蟲草素提取率顯著性影響因素分析=0.9874與R2=0.9770接近，該模型具有較好的解釋力，精密度28.651＞4，Plackett-Burman試驗設(shè)計可信度和精確度較好，各因素對響應(yīng)值的影響可由P值看出，提取液料比（X5）對蟲草素提取率影響極顯著，超聲時間（X1），超聲溫度（X2）對蟲草素提取率影響顯著，故選擇此3個因素為響應(yīng)面法試驗因素。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平

表2 N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

2.3 響應(yīng)面Box-Behnken試驗結(jié)果與分析

結(jié)合單因素試驗和Plackett-Burman結(jié)果，利用響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計，固定提取次數(shù)（3次），超聲功率（120 W），選擇超聲時間（X1）、超聲溫度（X2），提取液料比（X5）為自變量，蟲草素提取率（Y）為因變量，響應(yīng)面試驗因素水平見表4，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面Box-Behnken試驗因素水平

表5 響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design-Expert.V8.0.6軟件對響應(yīng)面Box-Behnken試驗結(jié)果進行二次多元回歸方差擬合，獲得回歸方程為：Y=0.067+0.016×X1+6.013×10～3X2+0.029X5-5.975×10-3X1X2-2.883×10-3X1X5+1.100×10-3XX-7.326×10-3-3.159×10-3+4.899×10-3根據(jù)回歸方程模型方差分析顯示：模型P值極顯著，失擬項P值0.0625＞0.05不顯著，蟲草素提取率（Y）與回歸方程關(guān)系好，誤差較小，相關(guān)系數(shù)R2=0.9948，模型擬合程度好，R2Adj=0.9882與R2接近，有較好的解釋力，可以解釋98.82%的響應(yīng)值變化，該模型可用于北蟲草小麥殘基中蟲草素提取率分析與預(yù)測，具體見表6。

從響應(yīng)面Box-Behnken試驗?zāi)Ｐ头讲罘治霰?中顯示回歸方程一次項X1、X2、X5、二次項X12、X52的P值均達到極顯著的水平，二次項X22的P值為顯著水平，說明超聲時間、超聲溫度、提取液料比對蟲草素提取率影響顯著。二次項X1X2的P值極顯著，表明超聲時間與超聲溫度的交互作用對蟲草素提取率影響極顯著。從圖2的響應(yīng)面與等高線中可以看出，超聲時間和超聲溫度對蟲草素提取率的影響均呈拋物線型，等高線斜率大，曲面較陡。當(dāng)固定提取液（mL）料（g）比為20，蟲草素提取率隨著超聲時間延長不斷升高后呈拋物線下降趨勢，當(dāng)超聲時間為45 min，蟲草素提取率最大，超聲溫度提高到60℃，拋物線達到至高點，隨后蟲草素提取率呈下降趨勢。

表6 響應(yīng)面Box-Behnken試驗?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

圖2 超聲時間和超聲溫度交互作用對蟲草素提取率影響的曲面和等高線圖

根據(jù)表5試驗結(jié)果得到回歸方程，進一步分析獲得最優(yōu)提取工藝條件：當(dāng)超聲時間45 min，超聲溫度45℃，提取液（mL）料（g）比20時，蟲草素提取率理論預(yù)測值為0.1037%，實驗過程中預(yù)測值95%可能性在0.0941%到0.1133%之間。

最優(yōu)提取工藝條件驗證試驗：對最優(yōu)工藝進行3次重復(fù)試驗取平均值為0.0994%，低于理論值，但在預(yù)測值范圍內(nèi)，說明響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計得到超聲提取模型準(zhǔn)確可靠。具體見表7。

表7 最優(yōu)提取工藝驗證

3 小結(jié)

采用超聲提取北蟲草小麥培養(yǎng)殘基中蟲草素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗篩選出顯著性影響因素。通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化北蟲草小麥培養(yǎng)殘基中蟲草素超聲提取工藝，結(jié)果表明：超聲提取北蟲草小麥培養(yǎng)殘基中蟲草素最優(yōu)工藝條件為：超聲時間45 min，超聲溫度45℃，提 取 液（mL）料（g）比 20，蟲 草 素 提 取 率 為0.0994%。