常壓室溫等離子體技術(shù)在微生物誘變中的應(yīng)用進(jìn)展

徐歡歡, 張紅兵, 李會(huì)宣, 李磊

河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 石家莊 050061

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，微生物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)境等許多生產(chǎn)領(lǐng)域，與人們生產(chǎn)和生活的關(guān)系日益密切。自然界中微生物的遺傳與突變是其生存的重要方式[1]，但自然突變率低，有效性和時(shí)效性均不理想[2]。因此，如果微生物的某些性能難以滿足需求，就必須通過(guò)物理、化學(xué)、生物等誘變方法，加速其突變進(jìn)程，再通過(guò)篩選獲得有益的突變來(lái)滿足需求。其中，物理誘變包括紫外線、X射線、微波、輻射及離子束注入等方法[3]，化學(xué)誘變最常用的是烷基化試劑、疊氮化試劑等化學(xué)試劑[4]。這些方法的基本原理都是通過(guò)對(duì)DNA造成損傷致使發(fā)生基因組水平上的突變，再通過(guò)篩選獲得目的突變菌株。但由于突變的隨機(jī)性，導(dǎo)致效率低、可控性差[5]。近年來(lái)，一些物理新興技術(shù)迅速發(fā)展，其中，常壓室溫等離子體誘變(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)技術(shù)以操作簡(jiǎn)單、條件溫和、安全便捷、突變效率高的優(yōu)勢(shì)在生物技術(shù)領(lǐng)域倍受青睞[6]。基于此，本文對(duì)ARTP誘變技術(shù)的原理及其在微生物誘變育種方面的應(yīng)用展開(kāi)綜述，以期為該技術(shù)相關(guān)應(yīng)用研究提供借鑒和幫助。

1 常壓室溫等離子誘變?cè)?/h2>

等離子體是由大量相互作用的非束縛狀態(tài)下的帶電粒子組成的宏觀體系，是物質(zhì)形態(tài)的第四態(tài)[7]。常壓室溫等離子體是常壓非平衡放電等離子體(atmospheric non-equilibrium discharge，APNED)的一種，由帶電粒子、自由基、中性粒子、光子及電磁場(chǎng)組成。ARTP誘變育種儀采用氦氣作為工作氣體，使氦氣在大氣壓下能夠產(chǎn)生高濃度活性粒子(激發(fā)態(tài)氦原子、氫原子和氧原子)的等離子體射流[8]。高濃度的活性粒子能夠使DNA單鏈或雙鏈發(fā)生斷裂，造成DNA損傷，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)應(yīng)急修復(fù)機(jī)制，引起微生物突變[9]。ARTP技術(shù)產(chǎn)生的突變也可以發(fā)生在微生物細(xì)胞表面，使胞內(nèi)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生變化進(jìn)而間接改變細(xì)胞的代謝途徑[10-11]。

2 ARTP誘變技術(shù)的應(yīng)用

ARTP誘變技術(shù)極大程度地加快了微生物誘變育種的進(jìn)程，在菌種改良，特別是提高微生物合成能力等方面應(yīng)用廣泛。

2.1 在生物酶制備方面的應(yīng)用

生物酶是一種微生物發(fā)酵后經(jīng)分離提取得到的耐高溫、無(wú)毒、無(wú)腐蝕性的高效且環(huán)保的生物制劑[12]，常應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織印染等行業(yè)。在提高微生物產(chǎn)酶能力方面，ARTP技術(shù)取得了很大的成功。吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)作為一種新型的氧化還原酶輔酶，在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。利用ARTP對(duì)高產(chǎn)PQQ菌株扭脫甲基桿菌AM1進(jìn)行誘變，突變株P(guān)QQ產(chǎn)量達(dá)到54.0 mg·L-1，是出發(fā)菌株的近3倍[13]。同時(shí)，ARTP技術(shù)的應(yīng)用也有助于提高生物酶的活性及其他酶學(xué)性質(zhì)。Wang等[11]以節(jié)肢桿菌KQ11為出發(fā)株進(jìn)行ARTP誘變，得到了2株突變體，其右旋糖酐酶的酶活分別提高了19%和23%。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸-γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶)能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間的交聯(lián)，具有改善蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、質(zhì)地結(jié)構(gòu)、口感等功能。利用ARTP誘變技術(shù)處理茂源鏈霉菌，誘變株的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活相比出發(fā)株提高了82%[14]。脂肪酶是一種重要的工業(yè)用酶，主要用于改進(jìn)食品風(fēng)味、水解油脂、皮革絹紡脫脂等。王興吉等[15]對(duì)產(chǎn)脂肪酶黑曲霉菌株AG007進(jìn)行ARTP誘變，成功選育出產(chǎn)脂肪酶活力較原始株提高了86%的突變株，并通過(guò)酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，其在0 ℃左右能夠保留30%的活性，表明該菌株是一種低溫脂肪酶。單寧酶是一種能水解沒(méi)食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵的水解酶[16]，常被應(yīng)用在化工、釀造、皮革、飼料、制藥、食品等行業(yè)。利用ARTP誘變技術(shù)處理黑曲霉B0201，誘變株產(chǎn)單寧酶酶活為17.61 U·g-1，是原始菌株酶活8.94 U·g-1的2倍左右，且傳代菌種產(chǎn)單寧酶穩(wěn)定性良好[17]。

2.2 在氨基酸制備方面的應(yīng)用

ARTP誘變技術(shù)在提高微生物合成氨基酸能力方面也發(fā)揮著顯著作用。ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是一種天然的賴氨酸同聚物，具有抑菌范圍廣、水溶性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好、安全性高、可降解等優(yōu)點(diǎn)，是食品防腐劑的理想選擇。賴永勤[18]以菌株SAB為出發(fā)菌株，進(jìn)行ARTP誘變，突變株ε-PL產(chǎn)量可達(dá)2.096 g·L-1，與原始菌株SAB(0.959 g·L-1)相比，提高了118.6%。L-異亮氨酸(L-isoleucine，L-Ile)是人體8種必需氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化妝品與醫(yī)藥行業(yè)。利用ARTP技術(shù)對(duì)黃短桿菌I-12進(jìn)行誘變，誘變后的菌株產(chǎn)酸量比出發(fā)菌株提高了44.75%[19]。L-谷氨酸(L-glutamate，L-Glu)是人體的非必需氨基酸，參與細(xì)胞內(nèi)多種氨基酸的合成過(guò)程，是目前世界上產(chǎn)量最大的氨基酸，在食品、醫(yī)藥行業(yè)、人造制革、化妝品工業(yè)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上都有廣泛的用途。梁玲等[20]以高產(chǎn)L-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌GY1為研究對(duì)象，進(jìn)行ARTP誘變，獲得的突變株搖瓶發(fā)酵L-谷氨酸含量較原始菌株提高了13.9%，且遺傳穩(wěn)定。

2.3 在藥物制備方面的應(yīng)用

通過(guò)ARTP技術(shù)對(duì)藥物生產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變，可有效提高菌種效價(jià)及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率等，大大優(yōu)化菌種性能，提高經(jīng)濟(jì)效益。螺旋霉素具有十分良好的體內(nèi)抗菌作用，且副作用較紅霉素小，可用于治療由革蘭陽(yáng)性菌和某些革蘭陰性菌引發(fā)的呼吸道疾病。周德龍等[21]以ARTP技術(shù)對(duì)螺旋霉素生產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變，得到的突變株效價(jià)較原始株提高了21.7%，且性狀相對(duì)穩(wěn)定。環(huán)孢菌素A(ciclosporin A，CyA)在代謝中可產(chǎn)生失去了免疫抑制活性的環(huán)孢菌素衍生物[γ-HyMeLeu4]CyA，其抗菌譜窄，但仍具有抗真菌特性。采用ARTP技術(shù)對(duì)稀有放線菌株進(jìn)行誘變，獲得了具有穩(wěn)定遺傳性能且[γ-HyMeLeu4]CyA的轉(zhuǎn)化效率比出發(fā)菌株提高32%左右的誘變株[22]。氫化可的松(hydrocortisone，HC)又稱皮質(zhì)醇、可的索，為腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，是甾體激素類藥物中產(chǎn)量最大的品種之一，同時(shí)也是很多甾體激素類藥物的中間體。利用ARTP-LiCl復(fù)合誘變方法對(duì)一株藍(lán)色犁頭霉進(jìn)行誘變，突變株的HC轉(zhuǎn)化率達(dá)72.52%，底物投料濃度和HC轉(zhuǎn)化率與原始菌株相比均有提高，且該菌株遺傳穩(wěn)定性較好[23]。雷帕霉素(rapamycin，RPM)是一種具有免疫抑制活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，是一種低毒性的抗真菌藥物和抗腫瘤藥物，后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)RPM也可用于治療阿爾茨海默癥。王欣榮等[24]采用亞硝基胍(nitrosoguanidine，NTG)、ARTP、核糖體工程育種復(fù)合方法處理產(chǎn)雷帕霉素游動(dòng)放線菌SIIA-1602，獲得的誘變株發(fā)酵水平較原始菌株提高了55.7%；同時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中該突變株總氮源使用量減少了一半，放罐過(guò)程中氨基氮排放量和菌渣量也明顯降低，在環(huán)保方面也取得了顯著的成效。

2.4 在有機(jī)酸制備方面的應(yīng)用

對(duì)產(chǎn)有機(jī)酸菌株加以ARTP誘變，可明顯提高其產(chǎn)酸速率、產(chǎn)酸量及菌株穩(wěn)定性，ARTP誘變技術(shù)對(duì)有機(jī)酸的生產(chǎn)也具有重要意義。乳酸是三大有機(jī)酸之一，因其安全性高、光學(xué)活性小，常被應(yīng)用在食品、制藥、皮革等領(lǐng)域。王光耀[25]通過(guò)ARTP技術(shù)處理擬干酪乳桿菌，結(jié)合高通量篩選方法，成功選育出一株產(chǎn)乳酸速率快，且糖轉(zhuǎn)化率和單位菌體產(chǎn)乳酸量較高的突變株。檸檬酸是一種十分重要的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)。利用ARTP對(duì)檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉進(jìn)行誘變，與出發(fā)菌株(產(chǎn)酸12.46 g·dL-1)相比，誘變株產(chǎn)酸增幅達(dá)到8.67%[26]。丙酮酸是近年來(lái)需求量不斷增加的一種重要有機(jī)酸，在化工、制藥、農(nóng)用化學(xué)品等領(lǐng)域被廣泛使用。司曉光等[27]通過(guò)ARTP誘變技術(shù)處理光滑球擬酵母，成功選育出一株誘變株，其丙酮酸產(chǎn)量較原始株提高了13.69%，且該誘變株可穩(wěn)定遺傳。

2.5 ARTP技術(shù)在微藻領(lǐng)域的應(yīng)用

同樣，ARTP也適用于微藻的誘變育種。由于微藻中的脂肪酸可轉(zhuǎn)化成為被視為化石能源替代品的新型清潔燃料——生物柴油，且其具有分布廣、易獲取、可再生、繁殖速度快、生產(chǎn)效率高、脂肪含量高、不競(jìng)爭(zhēng)農(nóng)業(yè)耕地等[28-29]優(yōu)勢(shì)，深受學(xué)者們的青睞，但成本較高等問(wèn)題一直是微藻油脂工業(yè)化生產(chǎn)道路上的限制因素[30]。目前，降低成本的方法有優(yōu)化培養(yǎng)基、提高微藻油脂產(chǎn)量、簡(jiǎn)化油脂制備工藝等。而要提高油脂產(chǎn)量，選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的藻種是最關(guān)鍵也是最有效的途徑之一。吳娟[31]為獲得高產(chǎn)油異養(yǎng)小球藻誘變株，采用ARTP技術(shù)對(duì)小球藻進(jìn)行了誘變，獲得的突變株油脂含量較出發(fā)藻株含量高約5.4%。

除了油脂含量發(fā)生變化，通過(guò)ARTP誘變后微藻中其他成分元素含量也會(huì)發(fā)生變化。吳曉英等[32]通過(guò)ARTP誘變篩選獲得高產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻突變株，該突變株的生物量和生長(zhǎng)速率較出發(fā)株均有明顯提高，突變株的蝦青素含量達(dá)3.1%，較出發(fā)株提髙了51.96%；蝦青素產(chǎn)量為71.92 mg·L-1，相比于出發(fā)株提高了61.73%；且遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，誘變株生產(chǎn)性能穩(wěn)定。

本課題組目前正在進(jìn)行微藻的相關(guān)研究，在采用ARTP誘變技術(shù)對(duì)本課題組篩選分離得到的小球藻進(jìn)行突變的研究中發(fā)現(xiàn)突變株較親本藻株油脂含量稍高(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

2.6 在其他領(lǐng)域的應(yīng)用

2.6.1在食品方面的應(yīng)用 在食品方面，利用ARTP誘變技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行誘變后，其生物活性、生長(zhǎng)速度、發(fā)酵效率等特性均有大幅提升。猴頭菌是重要的食藥用真菌[33]，具有增強(qiáng)免疫、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等功效[34]。采用ARTP誘變技術(shù)3株高產(chǎn)多糖猴頭菌，結(jié)果表明誘變株的多糖活性優(yōu)于出發(fā)株[35]。柱狀田頭菇(茶樹(shù)菇)富含大量蛋白質(zhì)、氨基酸、B族維生素及豐富的礦質(zhì)元素。王謙等[36]通過(guò)ARTP誘變技術(shù)對(duì)柱狀田頭菇進(jìn)行誘變處理，得到的突變株的長(zhǎng)速、長(zhǎng)勢(shì)、生物學(xué)效率均高于出發(fā)株，是能夠高效利用荔枝屑生產(chǎn)的新菌株。醋酸菌(acetic acid bacteria)是一類能通過(guò)呼吸作用將乙醇氧化成醋酸的需氧微生物，是食醋固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的重要產(chǎn)酸菌。采用ARTP對(duì)醋酸菌進(jìn)行誘變，篩選得到的誘變株發(fā)酵周期縮短約7 h，發(fā)酵效率提高約10%[37]。同時(shí)，利用ARTP技術(shù)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行誘變，在提高其產(chǎn)酒精產(chǎn)酸、降低啤酒中嘌呤及白酒中高級(jí)醇方面也有明顯效果[38-40]。細(xì)菌素是一類由某些細(xì)菌分泌的具有抗菌活性的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其分類中的Ⅰ類和Ⅱ類(Class Ⅰ、Class Ⅱ)常作為生物防腐劑，被廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)領(lǐng)域。安宇等[41]采用四輪微波-NTG-ARTP-UV復(fù)合誘變方法，對(duì)具有降膽固醇能力的植物乳桿菌進(jìn)行誘變，獲得了1株保留降膽固醇能力的高產(chǎn)細(xì)菌素突變株，且該突變株產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌譜較寬，對(duì)除枯草芽孢桿菌以外的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌均有抑制作用。

2.6.2在能源方面的應(yīng)用 ARTP誘變技術(shù)在能源生產(chǎn)領(lǐng)域也有一些成功應(yīng)用的案例。采用ARTP誘變技術(shù)對(duì)乙酰丁酸梭菌Clostridiumacetobutylicum進(jìn)行誘變處理，獲得的突變菌株發(fā)酵葡萄糖可產(chǎn)生11.3 g·L-1丁醇，較出發(fā)菌株提高了31%，同時(shí)突變菌株能以木薯粉作為唯一底物，在優(yōu)化發(fā)酵條件后，最終可產(chǎn)生12.9 g·L-1丁醇和20.7 g·L-1總?cè)軇42]。產(chǎn)電菌也稱作胞外呼吸細(xì)菌，是一類能夠?qū)⒓?xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的電子傳遞到胞外的微生物，廣泛存在于自然界中，它們通過(guò)厭氧呼吸將電子供體有機(jī)物氧化并產(chǎn)生電子，是新型產(chǎn)電能裝置微生物燃料電池(microbial fuel cell, MFC)中的重要組成部分。何慧[43]以模式產(chǎn)電菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP誘變，通過(guò)電化學(xué)探針和高通量方法篩選出的突變株1和突變株5在第1個(gè)產(chǎn)電周期內(nèi)達(dá)到的最大電流密度，比出發(fā)菌株分別提高約38%和12%，結(jié)果說(shuō)明ARTP能夠提高菌株的產(chǎn)電能力，可快速突變此菌株基因組。因鼠李糖脂具備乳化、增溶及降低界面張力等功能，在能源、石油化工、醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域均有較大應(yīng)用前景。采用ARTP對(duì)銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaC3進(jìn)行誘變，最終選育出的突變株的鼠李糖脂產(chǎn)量比原始株菌株提高了74.1%[44]。

2.6.3在農(nóng)業(yè)與環(huán)境方面的應(yīng)用 阿維菌素(avermectin，AVM)是由阿維鏈霉菌(Steptomycesavermitilis)產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是一種高效的生物殺蟲(chóng)劑，具有殘留低、安全、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在農(nóng)林業(yè)與養(yǎng)殖行業(yè)。田萍萍等[45]對(duì)阿維鏈霉菌9-39菌株進(jìn)行ARTP誘變篩選及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究，結(jié)果表明ARTP誘變技術(shù)能顯著提高阿維菌素的產(chǎn)量。

3 展望

ARTP誘變技術(shù)以高效、安全、操作簡(jiǎn)單、環(huán)境易得等諸多優(yōu)點(diǎn)深受學(xué)者們的青睞，對(duì)選育性能優(yōu)越的微生物具有良好的應(yīng)用效果。目前已在食品、醫(yī)藥相關(guān)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，效果十分明顯。但在環(huán)境修復(fù)、能源、微藻利用等領(lǐng)域應(yīng)用較少，隨著ARTP技術(shù)的逐步完善和作用機(jī)理研究的不斷深入，在這些領(lǐng)域的應(yīng)用前景也將會(huì)更為廣闊，該技術(shù)的利用效益也會(huì)最大化。此外，ARTP技術(shù)除了可結(jié)合基因組學(xué)，在分子水平上對(duì)微生物進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用研究，也可以在新型環(huán)保材料的研發(fā)生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)細(xì)胞定向誘導(dǎo)的研究以及細(xì)胞融合等方面綜合利用，并不斷拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域，使ARTP技術(shù)成為推動(dòng)社會(huì)進(jìn)步、人類發(fā)展的重要技術(shù)工具。