新型冠狀病毒核酸與抗體檢測影響因素的分析評價

劉若錦，李揮，王麗(通信作者)，張秀杰(通信作者)，張曉剛

1 河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗研究院 (河北石家莊 050227)；2 英諾特(唐山)生物技術有限公司 (河北唐山 063000)

新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2)與SARS病毒(SARS-coronavirus，SARS-CoV)有系統(tǒng)相似性。由于SARS-CoV-2的迅速傳播，2019年冠狀病毒已被世界衛(wèi)生組織宣布為國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[1]。截至2020年5月5日，全球已記錄有3 517 348例實驗室確診病例和243 401例死亡病例[2]。

由于感染SARS-CoV-2患者的臨床表現(xiàn)從輕微(或無)到包括死亡在內的嚴重體征和癥狀不等[3]，因此，醫(yī)學專家確診SARS-CoV-2需要高度依賴診斷法[4]。在此，我們簡要討論SARS-CoV-2的不同檢測技術，并重點討論不同檢測技術在臨床檢驗中出現(xiàn)結果誤判的可能原因。

1 SARS-CoV-2概述

冠狀病毒是一種包被的無節(jié)段正性RNA病毒，屬于原冠狀病毒亞科。SARS-CoV-2、SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome-coronavirus，MERS-CoV)均起源于β型冠狀病毒。雖然一部分人感染新型冠狀病毒的癥狀是輕微的，但其具備潛在的致命性。目前，雖然SARS-CoV-2的病死率(約6.9%)低于SARS-CoV(10%)和MERS-CoV(34%)[2,5-6]，但其傳播率可能高于兩者[7]。澳大利亞國立大學流行病學家梅魯·謝爾也表示，很多SARS-CoV-2確診病例只有輕微癥狀，患者表現(xiàn)出來的發(fā)熱、咳嗽等癥狀在流感和其他呼吸道病毒感染中很常見，因此，醫(yī)學專家確診SARS-CoV-2病例需要高度依賴診斷法[4]。

對SARS-CoV-2的快速、準確的診斷有助于公共衛(wèi)生的準確監(jiān)測、疾病預防和有效的管理控制。目前，可檢測病毒的技術主要針對病毒正鏈單股RNA、抗體等[8]。多個實驗室和公司開發(fā)了不同類型的SARS-CoV-2的診斷試劑。在我國，截至目前，國家藥監(jiān)局批準上市的包括核酸檢測試劑和抗體檢測試劑在內的檢測試劑共30個。雖然SARS-CoV-2檢測產品的預期質量與實際質量仍存在差距，但各國政府面對全球爆發(fā)的局勢正在努力提高檢測能力，并且已經認識到隨著為控制疫情而采取的對人群限制措施的解除，檢測將在今后的病毒控制中發(fā)揮關鍵作用。

2 核酸檢測及其影響因素

2.1 核酸檢測概述

核酸檢測是直接對所采集標本中的病毒核酸進行檢測，用于定性檢測 SARS-CoV-2疑似病例、疑似聚集性病例及其他需要進行SARS-CoV-2診斷或鑒別診斷樣本中的核酸；檢測過程包括標本處理、核酸提取、PCR檢測等步驟，平均檢測時間2～3 h；適用于咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液樣本；因其特異性強、靈敏度相對較高，是當前主要的檢測手段。

目前，新型冠狀病毒核酸檢測分為熒光PCR法、恒溫擴增-實時熒光法、雜交捕獲免疫熒光法、RNA捕獲探針法、恒溫擴增芯片法和聯(lián)合探針錨定聚合測序法。

2.2 核酸檢測假陰性的影響因素[9]

2.2.1病原學

由于SARS-CoV-2是單鏈RNA病毒，容易在傳播過程中發(fā)生變異，且人類對新型冠狀病毒的研究時間尚短，因此，當病毒RNA的引物設計區(qū)域發(fā)生突變時，會直接導致核酸檢測結果的假陰性。

2.2.2樣本

(1)采集時間與類型：《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》中指出，應采集患者發(fā)病3 d內的標本[10]進行核酸檢測，但SARS-CoV-2在人體內的潛伏期為2～7 d，很多患者的病程在就診時已經遷延了數(shù)天至數(shù)周，無法確定樣本采集時是否為檢測的最佳時期，亦不能確認樣本內病毒載量是否仍然處在方法學的檢測范圍內[11]；此外，不同的樣本類型，陽性率不同，例如鼻拭子優(yōu)于咽拭子[12]，檢測下呼吸道標本的準確性更高。(2)樣本的質量：采集患者的樣本應包含病毒，且病毒含量應達到核酸檢測的下限，影響樣本質量的因素包括采樣深度不夠，未成功采集到鼻腔深處含有病毒的細胞；有的患者鼻甲肥大、鼻道狹窄或者伴有鼻過敏癥狀，難以順利進入鼻腔采集樣本；采集過程中可能會誘發(fā)患者產生分泌物，降低樣本質量；未使用專用的病毒核酸采樣拭子與保存液；樣本的保存時間過長或者運輸中保存溫度過高。

2.2.3人員操作

檢測人員在核酸提取過程中需要加入病毒裂解液等試劑，操作步驟較多，任一環(huán)節(jié)的操作不當，均會影響檢測結果的準確性。

2.2.4儀器設備

為了保證檢測儀器、設備的準確性及檢測結果的精確性，工作人員需定期檢定與維護相關設備。例如，冰箱的溫度會影響樣本RNA的穩(wěn)定性，移液器的量程不準確會導致樣本的加樣誤差。

2.2.5試劑

在檢測過程中，如果采用了不恰當?shù)奶崛≡噭⒋蟠笥绊懖《镜臋z出，因此，核酸擴增試劑應選擇至少含SARS-CoV-2基因的兩個位點(開放讀碼框ORF1ab、N基因或E基因)；同時，還應關注由某些試劑盒引物設計的位點欠佳帶來的不利因素，應對其進一步優(yōu)化。

2.3 核酸檢測假陽性的影響因素[9]

檢測結果的假陽性主要是由核酸污染、非特異性擴增、基線設置不合理等因素造成的。(1)核酸污染：檢測中，由于在核酸提取前、提取環(huán)節(jié)、上機擴增期間等過程中均可能造成核酸的污染，因此，核酸檢測實驗室應獨立分區(qū)、單向流通，禁止跨區(qū)域操作，同時，獲取樣本所用的儀器設備也要避免交叉污染。(2)非特異性擴增：主要原因是試劑盒引物設計不具備特異性，因此會形成引物二聚體或引物自身形成發(fā)卡結構，進而產生非特異性熒光，導致假陽性。(3)基線設置不合理：設置基線的作用是扣除擴增起始階段的背景熒光信號，但如果背景信號過強，軟件可能會將背景信號誤認為擴增信號，這時會導致假陽性。

3 抗體檢測及其影響因素[13]

3.1 抗體檢測概述

SARS-CoV-2感染機體后，最早產生的是IgM抗體，但濃度低、維持時間短、親和力較低，是急性期感染的診斷指標；IgG抗體產生的較晚，但濃度高、維持時間長、親和力高，血清IgG陽性提示感染中后期或既往感染[14-15]。

抗體檢測包括膠體金法和磁微?；瘜W發(fā)光法。(1)膠體金法試劑盒分為檢測IgM抗體、檢測并區(qū)分IgM/IgG抗體、檢測但不區(qū)分IgM/IgG抗體的產品。膠體金法的平均檢測時間為15 min左右，無須復雜設備，操作便捷，可目視判讀結果，但其靈敏度一般低于化學發(fā)光法。(2)磁微?；瘜W發(fā)光法分為檢測總抗體、檢測IgM抗體、檢測IgG抗體。該檢測方法的靈敏度高，操作相對便捷，一般需要30～60 min。但需要配套的檢測設備，臨床推廣受限于設備的普及程度。

抗體檢測適用于血清、血漿和靜脈全血樣本，采樣相對簡便、樣本更穩(wěn)定?？贵w檢測是對人體血液中的抗體水平進行檢測，但在疾病感染早期，由于人體內可能還未產生抗體，存在檢測窗口期，且存在個體差異，因此，其可用于對核酸檢測陰性的病例進行輔助診斷及對病例的排查、篩查，但不能代替核酸檢測方法，即不能作為新型冠狀病毒感染的肺炎確診和排除的依據。

3.2 抗體檢測假陰性

(1)防腐劑和抗凝劑：使用防腐劑、抗凝劑處理后的樣本，會抑制辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的活性，因此導致假陰性。(2)樣本與試劑的保存：樣本保存時間過長，即使在冰箱中，IgG也會形成多聚體，并且抗體免疫活性會大大減弱；同時，試劑未在規(guī)定的條件下儲存也會影響檢測結果[16]。(3)人員操作：人員操作導致的對使用前試劑在室溫下平衡時間不足、試劑用量不足、試劑受到污染等，均會造成檢測結果假陰性。(4)層析速度：層析速度過快，抗原抗體復合物尚未與檢測線上的抗體結合，就會越出檢測線，造成假陰性。

3.3 抗體檢測假陽性[13]

(1)溶血或紅細胞標本：紅細胞內液中的多種酶可與底物發(fā)生非特異性反應，且血紅蛋白中亞鐵血紅素可催化底物造成檢測假陽性[17]；在檢測區(qū)堆積形成顏色較淺的非特異性條帶也會干擾目視判定的結果[18]。(2)纖維蛋白：由于離心機的轉速過低或離心時間太短導致血清中的纖維蛋白未能完全析出。(3)細菌污染：細菌可能含有內源性HRP，影響結果判讀[17]；此外，疏水的細菌碎片可以與金標粒子或與捕捉抗體發(fā)生結合，造成結果假陽性。(4)患者自身原因：如果患者有某些基礎疾病、存在免疫功能異常或長期服用某種藥物，其體內會產生蛋白抗體等自身抗體，可能會干擾檢測結果，造成假陽性[19]。

4 核酸與抗體聯(lián)合檢測

在感染SARS-CoV-2的不同疾病進展階段，依據核酸、IgM和IgG抗體的不同檢測結果，不僅可判定患者所處的感染時期，還可通過核酸與抗體聯(lián)合檢測提高診斷效率[13]，更有效地進行臨床檢測和疫情防控。

5 結語

核酸和抗體檢測的效率不盡相同，兩者聯(lián)合使用，可取長補短，不僅可以有效提高SARS-CoV-2的診斷準確性和時效性，還能更好地了解病毒載量和疾病進展，指導臨床診療工作。但經臨床實踐證實，SARS-CoV-2的檢測必須結合臨床、影像學、流行病學資料進行綜合分析，才能確診SARS-CoV-2患者，因此，有必要開發(fā)更靈敏和更特異的檢測技術和靶向治療方法，以滿足臨床的防控需求。此外，在實際應用過程中，由于不同廠家生產的試劑盒的性能尚無評價數(shù)據，因此，對試劑盒的靈敏度、特異度及準確性等指標亟待評估。