磺胺醋酰鈉滴眼液無菌檢查方法驗證

劉全芳，鄭紹忠，張 婷

解放軍第一七五醫(yī)院（廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院）藥劑科，福建漳州 363000

磺胺醋酰鈉滴眼液為廣譜抑菌劑，能抑制大多數(shù)革蘭陽性菌、沙眼衣原體以及部分革蘭陰性菌?！吨袊幍洹?005年版[1]規(guī)定對滴眼液只需進行微生物限度檢查即可，新頒布的《中國藥典》2010年版[2]對此規(guī)定作出了修改，變更為眼用制劑需進行無菌檢查?！吨袊幍洹?010年版規(guī)定建立無菌檢查法時，應(yīng)對該方法進行驗證，以證明該方法可用于該產(chǎn)品的無菌檢查。筆者用薄膜過濾法對3批磺胺醋酰鈉滴眼液進行無菌檢查，并對此方法進行了驗證，確定了磺胺醋酰鈉滴眼液無菌檢查的檢驗條件和方法[3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Htysteritest601集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）、HTY反復(fù)使用全封閉薄膜過濾器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），孔徑為0.45 μm、直徑為5 cm的微孔濾膜（上海市新亞凈化器件廠），DG-2B多功能恒溫箱（上海醫(yī)療器械廠）；HWS-400型恒溫恒濕箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；LDZX-40SCI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；101-2A型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司）。

1.2 試驗菌株

大腸埃希菌（escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、生孢梭菌（clostrididium sporogenes）[CMCC （B）64941]、 枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]（以上菌種均購于廈門市藥品檢驗所，其中大腸埃希菌為第4代，其余菌均為第3代）。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基，以上均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 試藥

磺胺醋酰鈉滴眼液（解放軍第一七五醫(yī)院藥劑科制劑室，規(guī)格：0.5%×8 ml，批號：100316、100401、100513），無菌氯化鈉注射液（解放軍第一七五醫(yī)院藥劑科制劑室，規(guī)格：0.9%×100 ml，批號：1000614）。

2 方法與結(jié)果

驗證操作環(huán)境為10000級潔凈條件下的局部100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。

2.1 菌液的制備

取經(jīng)35℃培養(yǎng)21 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 ml，用0.9%的無菌氯化鈉注射液稀釋至含菌數(shù)約為50～100 cfu/ml的菌懸液，做活菌計數(shù)備用；取經(jīng)35℃培養(yǎng)21 h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物1 ml，用0.9%的無菌氯化鈉注射液稀釋至含菌數(shù)約為50～100cfu/ml的菌懸液，做活菌計數(shù)備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)物1 ml，用0.9%的無菌氯化鈉注射液稀釋至含菌數(shù)為50～100 cfu/ml的菌懸液，做活菌計數(shù)備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，用5 ml 0.9%的無菌氯化鈉注射液洗脫下霉菌孢子，并將孢子懸液過濾至無菌試管內(nèi)，吸取1 ml孢子懸液，用0.9%的無菌氯化鈉注射液稀釋至含孢子數(shù)為50～100 cfu/ml的孢子懸液，做活菌計數(shù)備用。每批試劑平行做2次。菌液制備結(jié)果，見表1。

表1 菌液的稀釋度及菌落數(shù)（cfu/ml）

表2 各試驗菌的驗證結(jié)果

2.2 方法的驗證（薄膜過濾法）[4]

菌液組：將上述制備好的菌液各1 ml分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（50 ml/支）和改良馬丁培養(yǎng)基（50 ml/支）中。試驗組：取相同批號供試品3瓶，按照《中國藥典》2010年版無菌檢查薄膜過濾法進行過濾，即吸取藥液20 ml注入100 ml無菌氯化鈉注射液中，過濾，并用5袋無菌氯化鈉注射液（100 ml/袋）沖洗，在最后1袋沖洗液中加入相應(yīng)的試驗菌液1 ml，沖洗完后，取出濾膜，接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中。供試品對照組：方法同試驗組，但不加試驗菌?？瞻讓φ战M：取同批配制的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各1支作空白對照。

按規(guī)定條件將上述培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察。各試驗菌的驗證結(jié)果，見表2。

由以上試驗結(jié)果可知，采用薄膜過濾法，用無菌氯化鈉注射液作為溶劑和沖洗劑，即吸取20 ml供試品注入100 ml無菌氯化鈉注射液中，過濾，用5袋無菌氯化鈉注射液（100 ml/袋）沖洗，各試驗菌均在規(guī)定時間3～5 d內(nèi)生長良好，并與菌液組中相應(yīng)的菌落生長情況相似，且供試品對照組和空白對照組均無菌落生長，故可采用薄膜過濾法用無菌氯化鈉注射液作為溶劑和沖洗劑對磺胺醋酰鈉滴眼液進行無菌檢查。

3 討論

磺胺醋酰鈉滴眼液為短效磺胺類藥物，含有磺胺醋酰鈉成分，為廣譜抑菌劑，抗菌作用雖弱，但能抑制大多數(shù)革蘭陽性菌、沙眼衣原體以及部分革蘭陰性菌。為消除該藥的抑菌作用對試驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，筆者在選擇無菌檢查方法時選用薄膜過濾法，用500 ml無菌氯化鈉注射液（100 ml/次）分5次沖洗，可消除其抑菌活性，并不損傷濾膜，結(jié)果可靠且操作簡便，故可以用此法對其進行檢驗。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄ⅪH.

[2]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄ⅪH.

[3]肖莉.酚磺乙胺注射液無菌檢查的方法驗證[J].中國藥業(yè),2008,17(4):38.

[4]戴暈,劉鵬,馬仕洪,等.快速建立注射用頭孢菌素?zé)o菌檢查法的探討[J].藥物分析雜志,2007,27(2):208.