外泌體及與高血壓的研究進(jìn)展

星玉潔綜述，任 明審校

0 引 言

據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2017》中國(guó)心血管病患病率及死亡率處于持續(xù)上升階段[1]。據(jù)推算我國(guó)現(xiàn)有的心血管疾病患者為2.9億，其中高血壓患者推算有2.7億[1]。心血管疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類的健康及生活質(zhì)量，因此尋求新的、更為有效的治療方式迫在眉睫。越來越多的證據(jù)表明外泌體在心肌缺血、心肌梗死、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟瓣膜病等心血管疾病中均發(fā)揮著重要作用。外泌體之所以成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)有三大原因：外泌體在生理調(diào)控過程中扮演著重要的角色，有作為診斷標(biāo)記物以及治療候選物的巨大潛能[2]。文章就細(xì)胞外囊泡、外泌體的生物特性、外泌體與高血壓的相關(guān)研究作一綜述。

2 細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的概述

EVs是細(xì)胞釋放到細(xì)胞外微環(huán)境的膜性囊泡，可攜帶母細(xì)胞來源相關(guān)生物分子，參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3],具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能。相關(guān)研究表明幾乎所有物種的所有細(xì)胞均能分泌EVs，根據(jù)其釋放機(jī)制及大小主要分為：外泌體(直徑<150 nm)、微泡和凋亡小體(直徑>100 nm),最后兩種類型的囊泡分別從活細(xì)胞和死亡細(xì)胞的質(zhì)膜直接釋放出來[4]。

2 外泌體的基本生物特性

外泌體是最小的EVs，大小為30～150 nm不等[5]，含有脂類、蛋白質(zhì)、RNA和DNA[6]。在電鏡下可以觀察到外泌體是由鞘磷脂、膽固醇、神經(jīng)酰胺、磷脂酰絲氨酸等脂質(zhì)成分構(gòu)成的被雙層包裹的囊狀小泡[7]。外泌體的脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)使外泌體含量可以穩(wěn)定地保持，而不被各種循環(huán)酶消化。外泌體的形成是動(dòng)態(tài)而有序的過程：首先由細(xì)胞膜內(nèi)陷形成初級(jí)核內(nèi)體,然后核內(nèi)體膜進(jìn)一步內(nèi)陷形成多個(gè)腔內(nèi)囊泡,即為次級(jí)核內(nèi)體或多泡小體,多泡小體經(jīng)過溶酶體途徑后與細(xì)胞膜融合,再以胞吐的方式分泌到細(xì)胞外，即為外泌體[8]。外泌體的這種特殊的形成過程使其可以通過質(zhì)膜運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白(Annexins、GTPas-es、Foltillin)、四跨膜超級(jí)家族成員(如CD81、CD82、CD63、CD9 等)，熱休克蛋白(Hsp70、Hsp90)以及其他類型的蛋白(如細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì))[9]。

3 外泌體與非編碼RNA(miRNA)的相關(guān)性

miRNA是單鏈內(nèi)源性的非編碼RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯以及調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。外泌體可以通過供體細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA至受體細(xì)胞，這是一種細(xì)胞間信息交流的新方式，miRNA還參與了人體內(nèi)各種生理和病理過程，在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miRNA在煮沸、低pH、高pH、室溫狀態(tài)下長(zhǎng)期儲(chǔ)存，甚至多次凍融等苛刻條件下均能穩(wěn)定存在[10]；而與內(nèi)源性miRNA所具有的穩(wěn)定性相反，當(dāng)合成的miRNA 被外源性加入時(shí)，很快會(huì)被血漿中高水平的核糖核酸酶降解，這表明內(nèi)源性miRNA被某種機(jī)制保護(hù)以阻止其降解[11]。有研究表明miRNA可以被包裝在EVs中或與RNA相關(guān)蛋白或脂蛋白復(fù)合物結(jié)合以防止其降解，來源于內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體可將miR-143和miR-145同時(shí)傳遞給平滑肌細(xì)胞，影響其血管功能[12]。miRNA的表達(dá)水平與許多心血管疾病相關(guān)基因的表達(dá)功能失調(diào)有關(guān)，然而外泌體在高血壓的發(fā)生及發(fā)展中的具體作用和有關(guān)miRNA的表達(dá)譜仍需探索[13]。通過對(duì)源自心臟成纖維細(xì)胞的外泌體進(jìn)行miRNA含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)許多miRNA通常在細(xì)胞內(nèi)就發(fā)生降解，通過共聚焦顯微成像技術(shù)和共培養(yǎng)試驗(yàn)確定了源自成纖維細(xì)胞外泌體的miR-21是一種有效的具有旁分泌作用RNA分子，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，并有作為治療靶點(diǎn)的可能性[13]。Valadi等[14]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞來源的外泌體攜有121種不同的miRNA，其中一些miRNA在外泌體中的表達(dá)水平相對(duì)高于其供體細(xì)胞，這提示miRNA有向外泌體轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

Pegati等人證實(shí)細(xì)胞確實(shí)可以選擇性釋放以及保留部分miRNA，66%的miRNA的釋放量能夠反映它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的水平，其中13%的miRNA被細(xì)胞選擇性地保留(從而以較低水平釋放)，而另一方面21%的miRNA則被主動(dòng)釋放[15]。

4 外泌體與高血壓的相關(guān)研究

高血壓是全球范圍內(nèi)的重要健康問題，是心血管疾病、卒中和慢性腎衰竭的主要危險(xiǎn)因素。原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，遺傳、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem,RAAS)激活、內(nèi)皮功能障礙、血管重塑、細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常和胰島素抵抗均與高血壓的發(fā)生有關(guān)，然而其潛在的分子機(jī)制仍待探索，這對(duì)制定更好的防治策略具有重要意義[16]。心臟壓力負(fù)荷的增加可以引起心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和炎性細(xì)胞因子的分泌，而成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞又可通過自分泌與旁分泌方式進(jìn)一步促進(jìn)心室重構(gòu)。在心肌損傷、心臟機(jī)械負(fù)荷過重的作用下心臟發(fā)生重塑導(dǎo)致心肌纖維化、心肌質(zhì)量增加、心肌間質(zhì)成分增多和毛細(xì)血管相對(duì)減少使心肌增厚、心臟擴(kuò)大，收縮功能逐漸降低，從而導(dǎo)致左室肥厚。相關(guān)研究證明高血壓可增加心臟中聚集的巨噬細(xì)胞的量，而巨噬細(xì)胞來源的外泌體可激活內(nèi)皮細(xì)胞中的促炎性信號(hào)通路，巨噬細(xì)胞早期浸潤(rùn)心臟是血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)所誘導(dǎo)的高血壓心臟重構(gòu)中的關(guān)鍵步驟。缺氧是心肌纖維化中的重要因素，缺氧還增加了前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的表達(dá)，并增強(qiáng)了白細(xì)胞在血管中的聚集[17]， AngⅡ和缺氧是促炎性微環(huán)境的特征[18]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌納米大小的EVs作為細(xì)胞間通訊的非細(xì)胞工具[19]。各種類型的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，如血小板、白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等均能分泌EVs[20]。有研究以12周正常血壓的Wistar-Kyoto大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，使用離心速度(17 000×g)從缺乏血小板的血漿中分離出循環(huán)EVs，發(fā)現(xiàn)WKYs的循環(huán)EVs可以降低正常血壓的血管舒張，但對(duì)SHRs的血壓沒有影響。相比之下，SHRs的EVs則不能降低WKYs和SHRs的血管舒張。WKYs的EVs對(duì)血管舒張的抑制作用可能是通過抑制其內(nèi)皮細(xì)胞的NO合成酶來實(shí)現(xiàn)的，而來自正常人群的EVs也能抑制SHRs動(dòng)脈的血管舒張，但高血壓人群EVs則沒有這種效果[21]。

5 外泌體對(duì)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的作用

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活是高血壓的基礎(chǔ), 該系統(tǒng)由腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、AngⅡ、血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin type 1 receptor，AT1R)和血管緊張素Ⅱ 2型受體(angiotensin type 2 receptor，AT2R)組成。RAAS的終產(chǎn)物AngⅡ可引起血管收縮、血管平滑肌細(xì)胞增生、纖維化、心肌肥厚、交感神經(jīng)興奮性增加、心臟收縮力增強(qiáng)等，并且通過引發(fā)炎癥反應(yīng)促進(jìn)血管通透性增加。AngⅡ還能通過啟動(dòng)炎癥反應(yīng)引起血管損傷和血管重塑。Piront發(fā)現(xiàn)在心臟壓力超負(fù)荷下，心肌細(xì)胞會(huì)釋放出腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的關(guān)鍵受體AT1R[22]，AT1R本身含具有豐富腎素的外泌體，它能夠作用于心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并在神經(jīng)激素刺激血管的過程中起調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活均需要外泌體參與，目前是心血管和腫瘤研究的熱點(diǎn)[23]。

6 尿外泌體的相關(guān)進(jìn)展

腎功能受損并出現(xiàn)蛋白尿是臨床上用于評(píng)估心血管疾病進(jìn)程和腎功能惡化程度的重要指標(biāo)。RAAS的激活會(huì)改變尿外泌體的含量，氯化鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、α-上皮鈉通道和γ-上皮鈉通道與高血壓的進(jìn)展密切相關(guān)，高血壓患者尿外泌體的miRNA分析也證實(shí)了miR-615、miR-211等幾種miRNAs對(duì)血壓波動(dòng)敏感?？偟膩碚f，尿外泌體含量的研究在高血壓的預(yù)后預(yù)測(cè)中有著廣闊的應(yīng)用前景。相關(guān)研究表明高血壓患者無論是否已經(jīng)出現(xiàn)蛋白尿，檢測(cè)其尿外泌體中的蛋白(約21種)水平發(fā)現(xiàn)其與機(jī)體的粘多糖降解、凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)和氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)[24]。如新發(fā)蛋白尿的高血壓患者只有β-半乳糖苷酶表達(dá)增加，而甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2的表達(dá)下降；未出現(xiàn)蛋白尿的高血壓患者尿外泌體中上皮生長(zhǎng)因子水平增加、α-2巨球蛋白水平減少；出現(xiàn)蛋白尿患者尿外泌體中α-1抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白和銅藍(lán)蛋白表達(dá)增加。有研究表明外泌體中miR-146a的低表達(dá)與蛋白尿的存在有關(guān)，尿外泌體miR-146a可能是研究高血壓早期腎損傷的潛在有用工具[25]。因尿液標(biāo)本具有易于收集的優(yōu)點(diǎn)，近年尿外泌體的相關(guān)研究也成為新的熱點(diǎn)。

7 新一代測(cè)序在外泌體miRNA表達(dá)譜中的應(yīng)用

Liu對(duì)SHRs及WKYs的血漿外泌體miRNA進(jìn)行新一代測(cè)序發(fā)現(xiàn)了miRNA/總RNA比值并沒有明顯差異，但27種miRNA顯示出差異性表達(dá)，其中在SHRs血外泌體中23種上調(diào)，4種下調(diào)。進(jìn)一步利用基因分析發(fā)現(xiàn)差異性表達(dá)中表達(dá)最高的10種miRNAs(miR-378-5p/-187-3p/-383-5p/-486/-6329/-206-3p/-425-5p/-128-3p/-181c-3p/-6328/-486)可作為識(shí)別高血壓的特異性靶基因或者信號(hào)途徑(TGF-β及MAPK信號(hào)途徑)。近期Linda Cambier在通過長(zhǎng)期注射AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大和腎損傷的模型中發(fā)現(xiàn)心內(nèi)膜細(xì)胞源性的外泌體可延緩心肌肥大和心肌纖維化，可改善腎功能、減輕腎炎癥和纖維化，這些作用與免疫抑制因子IL-10在血清、心臟、脾和腎中表達(dá)水平的改變有關(guān)[16]，外泌體及其包含的非編碼RNA或許可作為治療高血壓相關(guān)的心血管和腎損傷的新療法。

外泌體的最新進(jìn)展及展望：外泌體具有生物相容性、生物屏障通透性、低毒性和低免疫原性等特性[26]，因此外源性miRNAs、小干擾RNA，甚至藥物都可以被包裹到原始的外泌體中[6]。相關(guān)研究證實(shí)將治療性miRNAs和小干擾RNA包埋到外泌體可通過以下途徑實(shí)現(xiàn)：①用一個(gè)編碼前體miRNAs/小干擾RNA的質(zhì)?；虿《巨D(zhuǎn)染供體細(xì)胞；②直接通過電穿孔將miRNAs或小干擾RNA合成到純化的外泌體中[27-28]；③利用商業(yè)的轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNAs[29]；此外超聲波、擠壓均可以增加藥物裝載的效率[30]。目前藥物體外組裝技術(shù)也在不斷發(fā)展中，藥物裝載可采用3種不同的方法：①將藥物直接并入純化的外泌體，如親脂小分子、低分子的抗氧化劑和抗癌藥物；②將藥物裝載到供體細(xì)胞，并最終裝載入外泌體；③通過編碼DNA直接使藥物表達(dá)。到目前為止，這些方法中的絕大多數(shù)都被應(yīng)用于腫瘤學(xué)，目前通過外泌體治療癌癥的早期臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)仍有限?？偟膩碚f，盡管外泌體在作為心血管疾病的診斷標(biāo)記物及治療候選物方面有著令人期待的前景，但外泌體的形成、釋放和清除方面還有許多問題仍待探索，還需要做大量的基礎(chǔ)研究及臨床調(diào)查[31]。