細(xì)胞脹亡的檢測方法

潘穎星，黎 驪綜述，薛 薇，陽 潔審校

0 引 言

細(xì)胞死亡對于組織發(fā)育和機(jī)體穩(wěn)態(tài)來說十分重要，同時也是生命基本過程之一。目前已知，細(xì)胞死亡方式包括凋亡、自噬、旁凋亡、脹亡、焦亡等[1-2]。其中，細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞主動性死亡過程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞萎縮和核碎裂[3-5]。許多藥物可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式來發(fā)揮抗腫瘤作用，但凋亡耐藥的發(fā)生也導(dǎo)致藥物未能產(chǎn)生理想效果。細(xì)胞凋亡這一細(xì)胞死亡方式已研究得較為深入、透徹，也具有較為成熟的檢測方法。細(xì)胞脹亡是一種被動性的細(xì)胞死亡方式，可由生物不相容的物理條件或化學(xué)試劑的非特異性毒性引起[6]，主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹和細(xì)胞核溶解[3-4]。近年來的研究表明，細(xì)胞脹亡是細(xì)胞死亡的一種重要方式，許多化合物如黃連素、青蒿酯、茄邊堿可誘導(dǎo)細(xì)胞脹亡的發(fā)生。細(xì)胞脹亡不同于細(xì)胞凋亡，因此對于凋亡耐藥或凋亡通路缺陷的腫瘤，誘導(dǎo)細(xì)胞脹亡有望能克服其耐藥性以及發(fā)揮抗腫瘤作用，有助于凋亡耐藥問題的克服、抗腫瘤新靶點的探索以及抗腫瘤新策略的發(fā)現(xiàn)。此外，細(xì)胞脹亡也參與了心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展[7-9]，對心血管疾病等的治療具有潛在的意義。

雖然細(xì)胞脹亡的現(xiàn)象早已有報道，但至今對其研究仍未深入與全面，對于細(xì)胞脹亡仍然沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。目前細(xì)胞脹亡的檢測主要還是以細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?yōu)榛A(chǔ)，同時輔以脹亡相關(guān)的生化改變等方面的內(nèi)容。目前有較少文獻(xiàn)對細(xì)胞脹亡現(xiàn)有的檢測方法進(jìn)行總結(jié)，因此本文就相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行整理與歸納，對現(xiàn)有細(xì)胞脹亡檢測方法的原理和優(yōu)缺點等進(jìn)行闡述，以供參考，也期望未來能有對這一細(xì)胞死亡方式更為明確、標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，為該領(lǐng)域的研究提供支撐。

1 細(xì)胞脹亡的概念和特點

1995年，Majno等[3]提出了脹亡(oncosis)這一細(xì)胞死亡方式的命名，并認(rèn)識到細(xì)胞脹亡是有別于細(xì)胞凋亡的另一種細(xì)胞死亡方式，認(rèn)為細(xì)胞脹亡是一種細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞膜完整性破壞、DNA裂解為非特異性片段、最后細(xì)胞溶解并伴有炎癥反應(yīng)的細(xì)胞死亡過程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核溶解。

細(xì)胞脹亡是一種不同于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡方式，具有一些與細(xì)胞凋亡截然相反的特點，這些特點對細(xì)胞脹亡的檢測起到十分重要的作用。

脹亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，細(xì)胞體積變大；胞膜局部向外隆起呈泡狀，生成的膜泡內(nèi)主要含液體，不含細(xì)胞器；線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生擴(kuò)張[10]；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分散，或在核膜和核仁周圍凝集，后期發(fā)生核溶解；細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞膜完整性被破壞；細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生溶解、外溢，致使細(xì)胞周圍產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)。而凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，排列分散；染色質(zhì)凝集、核碎裂；胞膜凹陷分割而產(chǎn)生凋亡體[11-13]；凋亡的膜泡中常有細(xì)胞器的存在；早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜保持完整，無周圍炎癥反應(yīng)[14]。可見凋亡細(xì)胞與脹亡細(xì)胞兩者具有不同的形態(tài)學(xué)特點，這對于脹亡細(xì)胞的診斷起重要的作用。

除了形態(tài)學(xué)特點之外，脹亡細(xì)胞還具有其他生物學(xué)特點。脹亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性被破壞，細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶、細(xì)胞內(nèi)容物釋放出細(xì)胞外[15-16]，而早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍保持完整性，無內(nèi)容物的泄漏；在瓊脂糖凝膠電泳中，由于凋亡細(xì)胞的 DNA裂解成180～200 bp或規(guī)律的、多倍長度的DNA片段而呈現(xiàn)出典型的DNA電泳梯帶，然而細(xì)胞發(fā)生脹亡時，DNA降解為大于1000 bp、無規(guī)律、長度不等的DNA片段，無典型的 DNA電泳梯帶，但也存在部分不出現(xiàn)梯形條帶的細(xì)胞凋亡和出現(xiàn)梯形條帶的細(xì)胞脹亡情況[17]；細(xì)胞凋亡是一種耗能的主動過程，而細(xì)胞脹亡是一種低耗能或不耗能的被動過程，由同一種刺激引起的細(xì)胞死亡，在ATP供應(yīng)充足時細(xì)胞發(fā)生凋亡，ATP缺少時細(xì)胞發(fā)生脹亡[18]。

這些細(xì)胞脹亡的特點有助于細(xì)胞脹亡的判斷和檢測。

2 細(xì)胞脹亡的檢測方法

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測 目前主要還是按照大多數(shù)學(xué)者所接受的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)診斷脹亡細(xì)胞。常用的方法是使用光鏡、時差顯微鏡、電鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)以及包括細(xì)胞核、細(xì)胞器、細(xì)胞膜等在內(nèi)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

2.1.1 光鏡觀察 即采用光學(xué)顯微鏡觀察脹亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，鏡下可觀察到脹亡細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、胞膜起泡、細(xì)胞質(zhì)空泡化等現(xiàn)象。此法操作簡易、結(jié)果直觀、成本較低、無需特殊儀器設(shè)備，但很難對同一個視野下的細(xì)胞進(jìn)行時間點的觀測，且主觀性大，對結(jié)果的判定缺乏特異性指標(biāo)。

2.1.2 時差顯微鏡觀察 采用時差顯微鏡對脹亡細(xì)胞進(jìn)行實時觀察與拍攝，此方法的優(yōu)點在于細(xì)胞培養(yǎng)與顯微鏡觀察拍攝均在一個體系內(nèi)，無需移動細(xì)胞，因此可對同一個視野下的細(xì)胞或單個細(xì)胞進(jìn)行各個時間點形態(tài)學(xué)的觀察，更易于觀察脹亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及了解脹亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點，特別是對細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞膜破裂現(xiàn)象的觀察。且此法不需標(biāo)記細(xì)胞或破壞細(xì)胞，可觀察到細(xì)胞真正的生長狀態(tài)，對細(xì)胞的生長過程做出動態(tài)的監(jiān)測和分析。此法優(yōu)于普通光學(xué)顯微鏡觀察。

2.1.3 電鏡觀察 脹亡細(xì)胞的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化已在上文中有所描述。透射電鏡可觀察到普通光鏡觀察不到的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，能清晰觀察到細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核和包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等在內(nèi)的細(xì)胞器變化或受損情況，是判定細(xì)胞死亡方式非常重要的一種方法。對于脹亡細(xì)胞而言，透射電鏡觀察是一種必不可少的檢測方法。有研究采用掃描電鏡觀察脹亡細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積增大，微絨毛部分退化或縮短直至完全消失，大小不一的膜孔形成，孔洞下的細(xì)胞骨架樣結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞膜嚴(yán)重脫落并露出細(xì)胞核[19]。對于脹亡細(xì)胞而言，掃描電鏡從立體角度展現(xiàn)脹亡細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化，是對透射電鏡結(jié)果的有力驗證。由于形態(tài)學(xué)結(jié)果具有一定的局限性，不能滿足定量的要求，因此還需在形態(tài)學(xué)結(jié)果的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他的檢測方法進(jìn)行驗證。

2.1.4 熒光顯微鏡觀察 采用細(xì)胞核染料如Hoechst等對細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記后于熒光顯微鏡下觀察。對于活細(xì)胞或固定過的細(xì)胞，Hoechst染料可穿過細(xì)胞膜與DNA結(jié)合發(fā)出藍(lán)色熒光，表現(xiàn)出經(jīng)熒光染料染色后的細(xì)胞核形態(tài)。核濃縮和核碎裂是凋亡的特征，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)Hoechst 33258染色后，凋亡細(xì)胞可見藍(lán)色破碎的細(xì)胞核現(xiàn)象，而脹亡細(xì)胞無此現(xiàn)象，可與凋亡細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別[20]，但當(dāng)細(xì)胞存在其他死亡方式時可能會干擾該結(jié)果的判定。 另有研究采用多通道全息顯微鏡觀察和區(qū)分脹亡與凋亡細(xì)胞，該法中的顯微鏡將熒光成像與全息顯微術(shù)相結(jié)合，讓兩種方法的聚焦面處于同一位置，這使得兩種方法之間可以很容易地轉(zhuǎn)換，在相同的條件和幾乎相同的時間點進(jìn)行成像[21]。

2.2 細(xì)胞膜完整性檢測 細(xì)胞發(fā)生脹亡的過程中，細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞膜完整性被破壞，且有人還提出一種由膜損傷啟動的細(xì)胞死亡機(jī)制假說，認(rèn)為細(xì)胞膜受損啟動了細(xì)胞脹亡的開關(guān)[22-23]。而細(xì)胞在早期凋亡過程中細(xì)胞膜依然保持完整性，因此可通過檢測細(xì)胞膜的完整性來與凋亡進(jìn)行區(qū)別。一方面即“進(jìn)入細(xì)胞”方面可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測碘化丙啶(PI)、Annexin-V/PI、7-氨基放線菌素D(7-amino-actinomycin D，7-ADD)等染料進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞的結(jié)合情況，另一方面即“流出細(xì)胞”方面可通過檢測細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放量、細(xì)胞內(nèi)容物泄漏量來反映細(xì)胞膜的完整性，由此來與細(xì)胞凋亡進(jìn)行區(qū)別同時驗證是否具有細(xì)胞脹亡的特點，也是對電鏡觀察結(jié)果的進(jìn)一步驗證。值得注意的是，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變和細(xì)胞膜完整性破壞不僅限于脹亡細(xì)胞，如焦亡細(xì)胞也具有細(xì)胞膜通透性改變、細(xì)胞膜完整性破壞的特點，另外，晚期凋亡細(xì)胞同樣也會有細(xì)胞膜損傷現(xiàn)象，因此對脹亡細(xì)胞的檢測除了進(jìn)行細(xì)胞膜完整性檢測之外，還應(yīng)聯(lián)合其他方法對細(xì)胞脹亡的其他特點進(jìn)行檢測。

2.2.1 碘化丙啶吸收試驗 碘化丙啶常用作細(xì)胞核染料。PI染料不能通過正常的細(xì)胞膜，但可通過受損的細(xì)胞膜從而對細(xì)胞核進(jìn)行染色。PI通過受損的細(xì)胞膜后與DNA發(fā)生結(jié)合發(fā)出紅色熒光，通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察或檢測細(xì)胞對PI染料的吸收情況可反映出細(xì)胞膜的完整或受損情況，因此可用細(xì)胞對PI染料的吸收作為判斷細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)。由于脹亡細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，可吸收PI呈現(xiàn)出較強(qiáng)的紅色熒光，而早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍保持完整性，對PI不吸收或較少吸收，因此可通過PI的吸收來與細(xì)胞凋亡進(jìn)行區(qū)別或者驗證是否具有細(xì)胞脹亡的特點。

2.2.2 Annexin-V/PI雙染 在細(xì)胞凋亡的早期，磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，與Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白Annexin-V發(fā)生高親和力特異性結(jié)合。使用標(biāo)記了熒光素如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)的Annexin-V與PI對細(xì)胞進(jìn)行雙染，通過流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究也將此法用于細(xì)胞脹亡的檢測，即活細(xì)胞不著色(Annexin-V-/PI-)，早期凋亡細(xì)胞僅能與Annexin-V結(jié)合呈綠色(Annexin-V+/PI-)，脹亡細(xì)胞能與 Annexin-V和PI結(jié)合呈綠色和紅色熒光(Annexin-V+/PI+)[24-25]。但中、晚期凋亡細(xì)胞也可呈現(xiàn)出綠色和紅色熒光(Annexin-V+/PI+)，因此僅憑流式細(xì)胞術(shù)這一結(jié)果還無法說明細(xì)胞脹亡的發(fā)生，但對細(xì)胞凋亡的檢測和排除具有一定的作用。

2.2.3 7-ADD染色 7-ADD染料可以通過破損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞與核酸結(jié)合，有研究通過流式細(xì)胞儀檢測7-ADD與細(xì)胞的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜破損的脹亡細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)力的7-ADD摻入現(xiàn)象[26]。但7-ADD染色的結(jié)果對于細(xì)胞脹亡而言仍不具有特異性。

2.2.4 乳酸脫氫酶釋放試驗 發(fā)生脹亡的細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變、細(xì)胞膜受損或破裂，此時細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶可釋放到細(xì)胞外[15]，因此上清中有較多乳酸脫氫酶的存在。通過對乳酸脫氫酶釋放量的檢測可反映細(xì)胞膜受損情況，有助于對細(xì)胞脹亡的判定。

2.2.5 細(xì)胞內(nèi)容物泄漏試驗 細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏是細(xì)胞膜受損的一個特征[16]，脹亡細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變、細(xì)胞膜受損或破裂，此時細(xì)胞內(nèi)容物可從細(xì)胞中泄漏，泄漏的內(nèi)容物對260 nm波長具有一定的吸收。通過對細(xì)胞內(nèi)容物泄漏量的檢測也可反映細(xì)胞膜受損情況，有助于對細(xì)胞脹亡的判定。

2.3 DNA梯形帶檢測 瓊脂糖凝膠電泳實驗也可在一定程度上證明脹亡的存在。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，Ca2+、Mg2+依賴型核酸內(nèi)切酶與相關(guān)蛋白水解酶被激活，將 DNA 降解。由于凋亡細(xì)胞會斷裂成180～200 bp大小或其倍數(shù)的DNA片段，因此在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中呈現(xiàn)典型的梯形條帶；而脹亡細(xì)胞DNA裂解成彌漫性隨機(jī)片段，電泳結(jié)果呈現(xiàn)出隨機(jī)性電泳條帶，可與細(xì)胞凋亡進(jìn)行區(qū)別。但需注意的是，其他細(xì)胞死亡方式的存在會對該結(jié)果的判定產(chǎn)生一定的干擾性。

2.4 線粒體膜電位檢測 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,Δψm)是由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子或其他離子分布不均一而形成。線粒體膜透化作用包括孔洞或通道的形成，可導(dǎo)致線粒體膜電位的耗損，不少研究報道細(xì)胞脹亡與細(xì)胞線粒體膜電位的下降有關(guān)[2, 16]。線粒體膜電位的檢測可使用JC-1染料，JC-1具有膜電位依賴性而存于線粒體中。在線粒體膜電位較高的情況下，JC-1形成聚合物可聚集于線粒體的基質(zhì)中，發(fā)出紅色熒光；而在線粒體膜電位較低的情況下，JC-1表現(xiàn)為單體并無法聚集于線粒體的基質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光。從熒光顏色的轉(zhuǎn)變可反映出線粒體膜電位的變化，相關(guān)指標(biāo)為紅綠熒光顏色的比例。除了JC-1這一染料，羅丹明123也可用于線粒體膜電位的檢測。值得一提的是，細(xì)胞線粒體膜電位的下降不僅僅與脹亡相關(guān)，細(xì)胞凋亡和其他細(xì)胞死亡方式同樣也存在細(xì)胞線粒體膜電位下降的現(xiàn)象，故對于細(xì)胞脹亡而言，細(xì)胞線粒體膜電位的檢測不具有特異性，還需聯(lián)合其他的方法進(jìn)行檢測。

2.5 細(xì)胞ATP水平檢測 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞脹亡的一個有趣的區(qū)別是，它們分別是ATP依賴和ATP非依賴的過程。細(xì)胞凋亡是一種需要消耗ATP的主動耗能過程，而細(xì)胞脹亡不需要ATP的消耗便可發(fā)生，在 ATP不足的情況下補(bǔ)充ATP后，細(xì)胞可由脹亡轉(zhuǎn)向凋亡[18]，因此細(xì)胞內(nèi)ATP含量的檢測在證明細(xì)胞脹亡或區(qū)別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞脹亡中具有重要作用。細(xì)胞ATP含量的檢測可使用ATP檢測試劑盒來進(jìn)行檢測。ATP檢測試劑盒原理是螢光素經(jīng)螢火蟲螢光素酶催化產(chǎn)生螢光的這一過程需要ATP的能量供給，在底物與酶均過量的條件下，螢光的產(chǎn)生與ATP的濃度呈正相關(guān)，因此可通過螢光強(qiáng)度反映細(xì)胞ATP含量。另外也有采用其他原理如磷鉬酸比色法的ATP檢測試劑盒，肌酸和ATP受肌酸激酶催化后，反應(yīng)生成磷酸肌酸，檢測磷酸肌酸含量也可反映ATP的含量。值得注意的是，細(xì)胞ATP含量的檢測對于細(xì)胞脹亡而言亦無特異性，還需聯(lián)合其他的方法進(jìn)行檢測。

2.6 細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度檢測 細(xì)胞脹亡的發(fā)生與細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度的升高有關(guān)，鈣離子濃度可影響鈣依賴性的calpain蛋白酶的激活以及作為調(diào)節(jié)線粒體膜通透性的另一機(jī)制。對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測可以使用對鈣離子敏感的Fluo-3/AM 熒光染料，F(xiàn)luo-3/AM 可結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中游離的鈣離子并發(fā)出綠色熒光，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測熒光強(qiáng)度從而反映鈣離子濃度。同上，鈣離子濃度的檢測對于細(xì)胞脹亡而言無特異性，需聯(lián)合其他方法。

2.7 細(xì)胞ROS水平檢測 生理水平的ROS可以作為信號分子調(diào)控轉(zhuǎn)錄，但過量生產(chǎn)的ROS會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞內(nèi)分子和細(xì)胞器，最終導(dǎo)致壞死。近年來有多篇文獻(xiàn)報道了細(xì)胞脹亡與ROS的過量生成相關(guān)，如有研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞死亡，其機(jī)制是由ROS介導(dǎo)的細(xì)胞脹亡死亡方式[20, 24]。對細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平的檢測可使用熒光探針DCFH-DA。其原理是無熒光性的DCFH-DA可透過細(xì)胞膜，DCFH被ROS氧化成具有熒光性的DCF，從而由原本的無熒光性變成具有熒光性。DCF的熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。同上，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測對于細(xì)胞脹亡而言無特異性，需聯(lián)合其他方法。

2.8 細(xì)胞脹亡相關(guān)蛋白的檢測 通過Western blot實驗檢測porimin和calpain蛋白的表達(dá)情況。

porimin也被稱為促脹亡受體。據(jù)研究報道，抗porimin蛋白可以迅速誘導(dǎo)T細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞經(jīng)歷一種獨特的細(xì)胞死亡形式，出現(xiàn)細(xì)胞聚集、形態(tài)改變、細(xì)胞膜孔形成和膜泡生成、細(xì)胞膜通透性改變等現(xiàn)象，與脹亡的特點相吻合，又采用免疫印跡和免疫共沉淀等方法發(fā)現(xiàn)了一個110 kDa的細(xì)胞表面受體，由此用抗porimin蛋白定義了這個介導(dǎo)細(xì)胞脹亡的細(xì)胞表面受體為porimin[27]。porimin蛋白的檢測對于細(xì)胞脹亡的判定具有重要作用，但僅對porimin蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，方法過于單一，應(yīng)加上形態(tài)學(xué)及其他檢測方法，更具說服力。

calpain是一種鈣依賴性的中性蛋白酶，已發(fā)現(xiàn)的哺乳動物calpain蛋白酶家族成員共有14個，可分為組織特異型和非組織特異型。非組織特異型的兩個亞型，μ-calpain和 m-calpain可分別由微摩爾和毫摩爾的鈣離子濃度激活[28]，calpain 1和calpain2分別為μ-calpain和 m-calpain。雖然不少研究表明calpain在細(xì)胞脹亡中起著重要作用，如有研究使用calpain抑制劑后可阻止細(xì)胞脹亡，但目前尚不清楚calpain的亞型與細(xì)胞脹亡的關(guān)系，對calpain 1與calpain 2的檢測均有脹亡相關(guān)的研究報道。鑒于calpain蛋白在細(xì)胞脹亡中起著關(guān)鍵作用，故應(yīng)與porimin蛋白一同檢測。

2.9 排除法

2.9.1 Annexin-V/PI雙染聯(lián)合Western blot的排除法有研究進(jìn)行Annexin-V/PI雙染，并通過Western blot實驗檢測了凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3和caspase-3底物PARP-1這兩者剪切形式的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨小檗堿濃度的增加，壞死和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量也明顯增加，但剪切型caspase-3和PARP-1的表達(dá)并沒有增加，說明小檗堿沒有激活caspase-3和PARP-1，沒有啟動凋亡，該法對細(xì)胞凋亡起到一定的排除作用[29]。

2.9.2 使用泛caspase、自噬、壞死抑制劑的排除法有部分研究通過加入泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK、壞死抑制劑Necrostatin-1或自噬抑制劑3-MA[30-31]，觀察這些抑制劑能否阻止藥物引起的細(xì)胞死亡，由此排除藥物引起的細(xì)胞死亡經(jīng)由凋亡、自噬、壞死途徑，接著在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上繼續(xù)探究細(xì)胞死亡是否由脹亡引起。該法在一定程度上能排除凋亡、自噬、壞死的方式，但也存在一定的缺陷，如不依賴caspase的凋亡、不經(jīng)由RIP1/3通路的壞死這類特殊情況無法排除，且也有研究者采用該法來研究旁凋亡，故此法不具有特異性，仍需聯(lián)合其他方法。還有研究加入泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK后觀察是否能抑制藥物引起的細(xì)胞腫脹和空泡化現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK不能阻止藥物引起的形態(tài)學(xué)變化，說明細(xì)胞腫脹和空泡化現(xiàn)象并不是由caspase依賴性凋亡引起，具有一定的排除作用[16]。

2.10 實時流式細(xì)胞術(shù)動力學(xué)分析法 有研究采用一種測量線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)和細(xì)胞膜電位(plasma membrane potential，PMP)變化的實時流式細(xì)胞術(shù)動力學(xué)分析方法來區(qū)別凋亡細(xì)胞和脹亡細(xì)胞[32]。即用染料DiIC1(5)和DiBAC4(5)分別標(biāo)記檢測細(xì)胞的線粒體膜電位和細(xì)胞膜電位，并結(jié)合Annexin-V- FITC和DAPI染料通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡過程中的持續(xù)25 min內(nèi)MMP和PMP信號變化不大，線粒體僅出現(xiàn)輕微的超極化；而加入誘導(dǎo)脹亡的化學(xué)試劑后立即導(dǎo)致超極化峰，隨后在25 min的過程中MMP完全耗竭且PMP也發(fā)生去極化，與細(xì)胞凋亡截然不同，根據(jù)這特點可將凋亡細(xì)胞與脹亡細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別。這種新型實時快速流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體功能變化和質(zhì)膜去極化的新方法使得標(biāo)準(zhǔn)化流式細(xì)胞術(shù)可用于細(xì)胞脹亡的實時化研究，也使得細(xì)胞脹亡在線粒體膜電位和細(xì)胞膜電位方面的特點隨之被發(fā)現(xiàn)。

3 結(jié) 語

了解不同的細(xì)胞死亡方式對于制定有效措施來阻止相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展和改善由細(xì)胞死亡引起的人類疾病至關(guān)重要。脹亡有別于凋亡，是重要的細(xì)胞死亡方式之一，越來越多的藥物也被發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)細(xì)胞脹亡的作用，細(xì)胞脹亡是一個亟待深入探索的研究領(lǐng)域。但目前對于細(xì)胞脹亡仍沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，且脹亡與其他的死亡方式存在著部分共同點，因此單獨一種檢測方法無法說明細(xì)胞脹亡的發(fā)生，需幾種方法的聯(lián)合使用以證明，但無論如何，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察為主要。細(xì)胞脹亡檢測方法選擇的不統(tǒng)一性在一定程度上限制了研究者們對脹亡的研究，希望未來能有對這一細(xì)胞死亡方式更為明確、統(tǒng)一、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)的檢測方法，為系統(tǒng)、深入地研究細(xì)胞脹亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用、探索潛在的抗腫瘤靶點以及研究脹亡參與其他疾病的病理機(jī)制等方面提供支撐。