miRNA對內(nèi)皮祖細胞作用的研究進展

尹航，王夢杰，劉祺，孔淑琦，劉文文，楊娜娜，趙英會

(1.山東第一醫(yī)科大學a.臨床醫(yī)學院，b.基礎(chǔ)醫(yī)學院，山東 泰安 271000； 2.濰坊醫(yī)學院生物科學與技術(shù)學院，山東 濰坊261000)

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細胞的前體，它可以增殖、分化形成內(nèi)皮細胞。在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)中，EPCs能夠修復損傷的血管內(nèi)皮，減緩As的發(fā)生。近年來，EPCs與As的研究已成為As治療研究中的熱點。微RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼RNA，具有調(diào)控生物生長發(fā)育和治療疾病的功能。研究證實，miRNA與血管發(fā)生密切相關(guān)[1]，在As的治療、診斷和風險預測中具有廣闊的應用前景。目前，關(guān)于miRNA在冠狀動脈事件發(fā)生過程中作用的研究較多，但對于miRNA在EPCs中的作用研究卻較少。研究表明，有些miRNA具有調(diào)控EPCs的功能[2]?，F(xiàn)就miRNA在EPCs中作用的研究進展予以綜述，以探討如何利用miRNA增強EPCs修復血管內(nèi)皮、改善As的作用。

1 miRNA相關(guān)介紹

1.1miRNA的作用及作用機制 1993年，人類首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)能夠控制細胞表達的miRNA，命名為lin-4[3]。目前，在超過200種物種中鑒定出超過25 000種miRNA (http：//www.mirbase.org)，miRNA是最近研究較多的內(nèi)源性非編碼小RNA，多存在于真核生物中。miRNA的生物學作用及作用方式較復雜，編碼miRNA的基因存在于細胞核中，被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成長度數(shù)千個堿基的初級轉(zhuǎn)錄物。在細胞核內(nèi)，初級轉(zhuǎn)錄物在蛋白質(zhì)復合體(400 000～500 000)的作用下經(jīng)過了第一次加工，該蛋白質(zhì)復合體由Drosha(RNase Ⅲ蛋白)和Pasha(雙鏈RNA結(jié)合蛋白)兩個蛋白質(zhì)組成，初級轉(zhuǎn)錄物在Drosha的作用下被加工成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體；miRNA前體在RanGTP/Exportin-5轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助下從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中；在細胞質(zhì)中，RNase Ⅲ酶家族的Dicer酶識別miRNA前體并通過對莖環(huán)結(jié)構(gòu)的剪切和修飾，使miRNA前體形成約20個堿基對長的miRNA產(chǎn)物，這種miRNA與Argonaute家族蛋白形成RNA誘導的沉默復合體，最終miRNA被降解，miRNA在轉(zhuǎn)錄后通過下調(diào)靶基因來調(diào)控基因的表達，該機制則取決于miRNA與靶基因信使RNA的互補程度，若兩者能形成完全互補的RNA雙鏈，則miRNA將雙鏈中的信使RNA降解，沉默基因轉(zhuǎn)錄后表達；若兩者形成非完全互補的雜交雙鏈，則會特異性地抑制基因表達。

miRNA在結(jié)構(gòu)和功能上具有一些鮮明的特點：①長度一般在20～25個堿基；②普遍存在于不同生物個體中，包括線蟲、果蠅、植物和人類等；③在不同的生物中，miRNA的序列具有一定的保守性，但尚未發(fā)現(xiàn)動物與植物之間有完全相同的miRNA序列；④有明顯的表達階段特異性和組織特異性；⑤基因組中的miRNA基因以多種形式存在，包括單拷貝、多拷貝或基因簇等；⑥一種miRNA可以靶向多種信使RNA(可超過200種)，且一種信使RNA也可由多種miRNA靶向。有研究顯示，miRNA可以調(diào)節(jié)30%以上的蛋白質(zhì)的編碼基因，表明其參與了細胞的生長、分化、衰老、凋亡、自噬、遷移、侵襲等多種過程，證實了其對基因表達的調(diào)節(jié)[4]。

1.2miRNA與As 正常內(nèi)皮細胞具有調(diào)節(jié)血管緊張度、抗凝、抗血小板等作用，還具有分泌纖溶蛋白、防止細胞向血管壁黏附聚集和抗炎癥反應的作用，故內(nèi)皮細胞損傷會引起并加劇As。在As發(fā)生過程中，首先表現(xiàn)出慢性炎癥對血管內(nèi)皮細胞的損傷，在趨化因子和黏附分子的共同作用下，單核細胞及T細胞等炎癥細胞遷移至動脈內(nèi)膜下分化為巨噬細胞，促進循環(huán)中單核細胞與內(nèi)皮細胞黏附，在血管壁中遷移、吞噬脂質(zhì)，進而衍化為巨噬泡沫細胞甚至粥樣病變。

多個miRNA參與調(diào)控動脈血管內(nèi)皮細胞慢性炎癥反應，影響As斑塊的發(fā)生發(fā)展。Wu等[5]研究顯示，miR-155通過對內(nèi)皮細胞的負反饋調(diào)節(jié)發(fā)揮抗As作用，其機制主要是通過抑制腫瘤壞死因子-α誘導單核細胞向內(nèi)皮細胞黏附。miR-125a-5p通過下調(diào)氧化固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白-9的表達，減少巨噬細胞對氧化型低密度脂蛋白的攝??；并且抑制白細胞介素-2、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等相關(guān)炎癥因子的基因表達[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移、促進內(nèi)皮細胞凋亡、誘導內(nèi)皮細胞衰老并阻滯細胞周期、參與血管內(nèi)皮細胞炎癥調(diào)節(jié)的作用[9-12]。由此可見，miRNA與As的緊密聯(lián)系，利用miRNA治療As具有廣闊的應用前景。

2 EPCs的相關(guān)介紹

2.1EPCs的特征 EPCs是血管內(nèi)皮細胞的前體，是一種多能干細胞，由Asahara等[13]于1997年利用免疫分選的方法從人外周血中分離出來。目前，人類已可以從臍血、骨髓、外周血和胚胎肝臟中分離培養(yǎng)出EPCs，其中骨髓中分離出的最多。未分化的EPCs呈圓形，形態(tài)上很難與其他細胞區(qū)分，現(xiàn)主要依靠細胞表面標志來區(qū)別。大多數(shù)學者認為，同時具有CD34+、CD133+和血管內(nèi)皮生長因子受體-2等表面抗原標志物的細胞稱為EPCs[14-16]。

2.2EPCS與As的研究進展 血管成形術(shù)或轉(zhuǎn)流手術(shù)后的內(nèi)皮損傷和脫失是形成As的重要病理基礎(chǔ)。加快損傷內(nèi)皮的修復，及時恢復穩(wěn)定的內(nèi)皮功能，能夠有效預防血栓形成。由于內(nèi)皮細胞是成熟的終末細胞，分化程度高且增殖能力低，當血管內(nèi)皮損傷時，內(nèi)皮細胞的修復能力有限，且一些較重的血管內(nèi)皮損傷不可逆轉(zhuǎn)；而EPCs可以通過分泌血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子促進內(nèi)皮細胞的血管新生[17]。Griese等[18]對球囊誘導兔頸動脈內(nèi)皮損傷剝脫實驗的研究發(fā)現(xiàn)，移植4 d時，自體移植EPCs組頸動脈內(nèi)皮損傷處基本已完全復內(nèi)皮化，而無EPCs移植對照組幾乎無復內(nèi)皮發(fā)生；4周后，自體移植EPCs組新生內(nèi)膜的形成較無EPCs移植對照組顯著增多。因此，EPCs可用于As的預防和治療。

3 miRNA調(diào)控EPCs功能的機制

3.1miRNA調(diào)控EPCs增殖 研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧狀態(tài)和發(fā)生As時，EPCs中miR-21的表達均增加，EPCs的增殖能力均下降[19]。EPCs中miR-21的敲低改善了缺氧誘導的細胞生長停滯。熒光素酶報告基因測定法顯示，miR-21通過直接靶向WWP1的3′非翻譯區(qū)下調(diào)含WW結(jié)構(gòu)域蛋白1(TGF-β信號傳導的負調(diào)節(jié)因子)的表達，而EPCs中miR-21過表達或WW結(jié)構(gòu)域蛋白1敲低顯著激活了TGF-β信號傳導途徑并抑制細胞增殖，表明miR-21可通過下調(diào)WW結(jié)構(gòu)域蛋白1激活TGF-β信號傳導來抑制EPCs增殖。

miR-221/222的生理作用與內(nèi)皮細胞的增殖也密切相關(guān)。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)測量穩(wěn)定冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)患者和非CAD患者。將CAD患者隨機分為阿托伐他汀組(口服阿托伐他汀10 mg/d)和普伐他汀組(口服普伐他汀10 mg/d)，治療12個月后，檢測兩組外周血EPCs中miR-221/222的水平顯示，CAD組miR-221/222水平顯著高于非CAD組(P<0.01)[20]。miR-221/222水平與CAD組EPCs數(shù)量呈弱負相關(guān)，推測miR-221/222可能抑制EPCs的增殖。

miR-10b和miR-196b能夠促進腫瘤EPCs的增殖[21-23]。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓內(nèi)的EPCs可以參與小鼠和人腫瘤血管生成依賴性生長的過程[24]。EPCs通過促血管生成生長因子的旁分泌以及直接參與新生血管調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的生成。miRNA是細胞過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，包括血管生成過程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA處理酶Dicer的基因消融，特別是減少了骨髓中循環(huán)EPCs的數(shù)量，導致血管生成抑制和腫瘤生長受損[24]。此外，miRNA的全基因組深度測序揭示了腫瘤EPCs的固有miRNA，包括miR-10b和miR-196b，被認為是HOX信號和成體干細胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。值得注意的是，miR-10b和miR-196b對血管內(nèi)皮生長因子的刺激均有反應，并在人類高級別乳腺腫瘤血管系統(tǒng)中表達增高。靶向miR-10b和miR-196b導致小鼠血管生成介導的腫瘤生長出現(xiàn)明顯缺陷[24]。因此，靶向上述miRNA可能是抑制腫瘤血管生成的新策略。

在糖尿病患者中，抑制miR-126基因表達會抑制EPCs增殖；而miRNA表達恢復后，EPCs的增殖也得到促進[25]。研究表明，miR-31a-5p是EPCs動員和內(nèi)皮化的重要調(diào)節(jié)因子，可能對動脈瘤修復有積極作用[26]。利用成年雄性Sprague-Dawley大鼠經(jīng)顯微外科制作螺旋栓塞動脈瘤模型，經(jīng)尾靜脈注射miR-31a-5p agomir或陰性對照agomir，劑量為10 mg/(kg·周)，持續(xù)4周，采用蘇木精-伊紅染色、電鏡掃描和流式細胞術(shù)觀察miR-31a-5p agomir對內(nèi)皮化和EPCs數(shù)量的影響發(fā)現(xiàn)，miR-31a-5p對EPCs活性和功能的影響則通過細胞計數(shù)試劑盒Kit-8、傷口愈合實驗和試管形成實驗來測定；檢測miR-31a-5p促進EPCs誘導的動脈瘤血管內(nèi)皮化的能力，與陰性對照組相比，miR-31a-5p agomir能改善內(nèi)皮化，增加外周血循環(huán)EPCs的數(shù)量。

3.2miRNA調(diào)控EPCs分化 miR-107可以調(diào)控EPCs的分化。從大鼠骨髓中分離EPCs，并通過實時熒光定量PCR測量缺氧和常氧時EPCs中miR-107的表達，使用慢病毒載體表達短發(fā)夾RNA和miR-107抑制劑靶向缺氧誘導因子-1β(hypoxia-inducible factor-1β，HIF-1β)和miR-107以改變HIF-1β和miR-107表達；在低氧條件下，EPCs中miR-107的表達增加，miR-107的上調(diào)部分抑制了缺氧誘導的EPCs分化，而miR-107的下調(diào)促進了EPCs分化，HIF-1β是相應靶基因，表明缺氧時miR-107上調(diào)并通過靶向HIF-1β阻止EPCs分化[27]。

流動剪切應力在EPCs分化調(diào)節(jié)中起重要作用，確定新型靶Forkhead盒j2(Foxj2)和miR-34a對剪切應力誘導的EPCs分化的影響。使用平行板流動室系統(tǒng)將人臍帶血衍生的EPCs暴露于15 dyn/cm2的層流剪切應力中，實時熒光定量PCR顯示，伴隨EPCs的內(nèi)皮分化，剪切應力顯著增加了miR-34a的表達；而Foxj2是由多種算法預測的miR-34a的推定靶標，在此過程中受到抑制[28]。采用雙熒光素酶報告基因測定以及miR-34a模擬物和抑制劑治療證實 miR-34a和Foxj2之間相互作用的研究揭示了miR-34a和Foxj2表達的逆相關(guān)性，同時涉及EPCs的內(nèi)皮分化[28]。miR-34a通過上調(diào)內(nèi)皮細胞標志物和下調(diào)平滑肌細胞標志物促進EPCs分化。此外，F(xiàn)oxj2過表達減弱了EPCs的內(nèi)皮分化，而Foxj2小干擾RNA具有相反的作用，這些數(shù)據(jù)表明了剪切應力誘導miR-34a表達的獨特機制，miR-34a靶向Foxj2并促進EPCs的內(nèi)皮分化[27]。既往研究顯示，糖尿病患者的內(nèi)皮功能障礙導致血管疾病，且EPCs對血管內(nèi)皮的功能性保存是必不可少的[29]。

以往Satb2被認為是EPCs中miR-31的功能相關(guān)靶標。有研究顯示，糖尿病患者EPCs中miR-31的表達顯著升高，且這種升高可在高葡萄糖條件下抑制細胞的增殖，此外，miR-31靶向Satb2還具有抗細胞凋亡和維持EPCs功能的作用[30]。敲低Satb2對健康和糖尿病患者EPCs的增殖和遷移均有抑制作用，呈現(xiàn)與miR-31過表達相同的趨勢，而Satb2過表達則顯示出相反的效果。在糖尿病受試者EPCs中發(fā)現(xiàn)，葡萄糖水平升高上調(diào)miR-31表達，導致了EPCs的功能障礙和死亡?？傊?，miR-31可能是糖尿病內(nèi)皮功能障礙的基礎(chǔ)，miR-31上調(diào)可能靶向Satb2，從而調(diào)節(jié)EPCs的分化[30-31]。

3.3miRNA調(diào)控EPCs遷移 在早期EPCs中，觀察到miR-150高表達與CXC趨化因子受體4低表達相關(guān)[28]。腺苷是一種具有心臟保護作用的核苷，可降低miR-150的表達、增加CXC趨化因子受體4的表達，增強EPCs的遷移[32]。這說明在缺血期間，miR-150下調(diào)骨髓來源的單核細胞中的CXC趨化因子受體4，EPCs的遷移能力減弱；當miR-150被抑制時，EPCs的遷移能力增強[33]。Sun等[34]研究發(fā)現(xiàn)，通過transwell實驗和管形成實驗研究miR-126的EPCs衍生外泌體(miR-126-Exo)對EPCs遷移和管內(nèi)結(jié)合能力的作用發(fā)現(xiàn)，miR-126-Exo可以增強EPCs的遷移和管內(nèi)結(jié)合能力。此外，EPCs還可高表達促血管生成的miRNA，如miR-31[35]，為miRNA調(diào)控EPCs的遷移奠定基礎(chǔ)。

3.4miRNA調(diào)控EPCs凋亡和衰老 EPCs衰老的潛在機制尚不清楚，但越來越多的證據(jù)支持miRNA在調(diào)節(jié)細胞衰老中的作用。Kato等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能參與了吸煙者EPCs的凋亡和衰老。Zhu等[37]研究亦證實，miR-10A*和miR-21通過抑制Hmga2表達調(diào)節(jié)EPCs的衰老。對糖尿病患者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可以抑制EPCs的凋亡[25]。糖尿病會嚴重影響循環(huán)EPCs的數(shù)量和功能，并可降低EPCs的修復能力，這是糖尿病血管病變發(fā)展的關(guān)鍵和始動因素。在此研究中，EPCs來自2型糖尿病患者和非糖尿病對照組，從EPCs中提取總RNA，經(jīng)基因芯片篩選和TaqMan實時熒光定量PCR篩選出miR-126，將表達miR-126和miR-126抑制劑的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至EPCs，檢測EPCs的凋亡敏感性，并進行Western Blotting和miRNA實時熒光定量PCR分析；同時為了研究其作用機制，制備了表達Spred-1的慢病毒載體和靶向Spred-1的小干擾RNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者EPCs中miR-126異常下調(diào)，而抗miR-126會增強EPCs的凋亡[25]。糖尿病EPCs中miR-126表達的恢復抑制了EPCs的凋亡能力，EPCs中miR-126過表達顯著下調(diào)Spred-1，而糖尿病EPCs中Spred-1表達下調(diào)抑制了EPCs的凋亡[25]，證明糖尿病患者EPCs中miR-126下調(diào)，且具有抑制EPCs凋亡的作用?？梢?，應用miRNA調(diào)控EPCs的凋亡和衰老具有很高的研究價值。

4 小 結(jié)

As是老年性常見疾病，嚴重影響人類健康。調(diào)控EPCs延緩或修復As血管內(nèi)皮是目前研究的熱點。miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的生物小分子，參與了多階段的生命過程，具有調(diào)控EPCs增殖、分化、遷移、凋亡和衰老的能力，體現(xiàn)了應用miRNA促進EPCs內(nèi)皮化以治療As的可行性。miRNA具有靶向多種蛋白質(zhì)編碼基因的能力，具有調(diào)節(jié)復雜生物過程(如血管生成)的潛力，但其多效性可能導致不良事件的發(fā)生，如何避免不良事件發(fā)生也是下一步研究的關(guān)鍵問題。目前，許多研究者聚焦miRNA調(diào)節(jié)EPCs的研究，未來應用miRNA調(diào)節(jié)EPCs治療As可能成為一種重要的方式。