黑色素瘤發(fā)病過程中與腫瘤相關(guān)成纖維細胞間的相互作用

胡泰然，雷鐵池

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科，武漢 430060)

皮膚黑色素瘤是一種最具侵襲性和致命性的皮膚癌癥，被認為是一種由遺傳易感和環(huán)境暴露等病因引發(fā)的多因素疾病，大多數(shù)由黑色素細胞形成的痣和色素斑惡變而來，其在皮膚癌癥相關(guān)死亡率中的占比較高。晚期黑色素瘤極具侵襲性，可經(jīng)血液系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，同時對傳統(tǒng)化學(xué)療法和放射療法具有特征性抵抗，預(yù)后較差[1-3]。既往研究表明，黑色素瘤的形成不僅僅與單一的惡性細胞有關(guān)，還與腫瘤基質(zhì)及腫瘤基質(zhì)細胞所構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，包括腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮細胞和免疫細胞等[4]。其中，CAFs是腫瘤微環(huán)境中最主要的基質(zhì)細胞之一，近年來，CAFs與腫瘤細胞的相互作用一直受到人們的廣泛關(guān)注。有證據(jù)表明，CAFs通過與腫瘤細胞的直接或間接接觸，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，使CAFs成為腫瘤治療的潛在靶點[5]。同樣，在黑色素瘤發(fā)病過程中，正常成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)可在黑色素瘤細胞誘導(dǎo)下活化形成CAFs，并與黑色素瘤細胞相互作用，促進腫瘤的生長、侵襲、致密結(jié)構(gòu)形成、血管形成、轉(zhuǎn)移甚至耐藥[3]。因此，總結(jié)并闡明黑色素瘤與CAFs間的相互作用機制對黑色素瘤治療新靶點的發(fā)現(xiàn)具有重要意義?，F(xiàn)就黑色素瘤發(fā)病過程中與CAFs間的相互作用予以綜述。

1 黑色素瘤中CAFs的起源和形成

1.1NFs與CAFs的特征 正常組織中的成纖維細胞是非上皮、非免疫性細胞，表現(xiàn)出經(jīng)典的紡錘形形態(tài)，具有可能的間充質(zhì)譜系起源，通常以單細胞的形式存在于間質(zhì)中，偶爾存在于毛細血管附近，與基膜無關(guān)聯(lián)。NFs通常處于靜止狀態(tài)，其代謝和轉(zhuǎn)錄組學(xué)活性極低。NFs具有分化為活化的成纖維細胞的能力，并可在隨后基于適當?shù)拇碳ぎa(chǎn)生其他間充質(zhì)譜系細胞[5]。

此外，CAFs還可指活化的成纖維細胞或活化的肌成纖維細胞，包括腫瘤相關(guān)的間充質(zhì)干細胞，其表型與NFs完全不同，而與肌成纖維細胞非常相似[5-6]?；罨蟮某衫w維細胞可以獲得更多的分泌表型、更強的增殖特性、專門的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重塑能力、強大的自分泌活化和動態(tài)免疫信號調(diào)節(jié)功能，進一步增加了腫瘤纖維化和腫瘤微環(huán)境的動態(tài)復(fù)雜性[4,7]。雖然CAFs和NFs均表達成纖維細胞特異性標志物，但α-平滑肌肌動蛋白、S100A4蛋白和成纖維細胞活化蛋白α等活化標志物分子僅在CAFs中表達[6]。

1.2NFs對早期黑色素瘤的抑制作用 在黑色素瘤發(fā)展的早期階段，NFs似乎與CAFs的功能相反，使用體外共培養(yǎng)模型時，NFs對來源于原發(fā)性黑色素瘤病變的腫瘤細胞有抑制性影響[8]。另有研究表明，當黑色素瘤第一次發(fā)生時，基質(zhì)中靜息的成纖維細胞會形成屏障，并分泌一些細胞因子和化學(xué)因子，如γ干擾素、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α，它們相互作用并抑制黑色素瘤細胞的生長[9]。此外，皮膚NFs形成的物理屏障也能阻止黑色素瘤細胞遷移并侵入周圍組織[3]。因此，NFs似乎抑制黑色素瘤在癌前病變時期的生長和進展。

1.3黑色素瘤主要以旁分泌方式促使CAFs的形成 隨著黑色素瘤的發(fā)展，黑色素瘤細胞分泌多種化學(xué)因子，誘導(dǎo)NFs細胞向黑色素瘤遷移、包圍，并滲入生長的黑色素瘤體[4]。這些信號還誘導(dǎo)基質(zhì)中NFs的表觀遺傳和生化變化，從而形成CAFs。黑色素瘤中產(chǎn)生的血小板衍生生長因子CC刺激NFs向腫瘤的募集，并促使NFs活化為CAFs[9-10]。黑色素瘤中分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β能誘導(dǎo)NFs分化和活化成為CAFs，且Nodal蛋白作為轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員，具有與之類似的功能[11]。

黑色素瘤細胞分泌的細胞外囊泡也可以誘導(dǎo)成纖維細胞重編程為CAFs。細胞外囊泡是由真核細胞釋放或脫落到腫瘤微環(huán)境中的細胞外細胞器，如外泌體和細胞微泡等。它們含有各種生物活性蛋白、信使RNA和微RNA(microRNA，miRNA/miR)，可在惡性細胞、CAFs、間充質(zhì)干細胞等細胞間被相互攝取，成為細胞間通訊的關(guān)鍵[12]。黑色素瘤細胞分泌的細胞微泡可介導(dǎo)NFs向CAFs轉(zhuǎn)變，并調(diào)節(jié)血管細胞黏附分子-1的表達，從而增強黑色素瘤細胞與CAFs的黏附；在缺氧刺激下，黑色素瘤細胞微泡在成纖維細胞中誘導(dǎo)更多胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2磷酸化，導(dǎo)致血管細胞黏附分子-1表達增加，從而產(chǎn)生更強的黏附作用[13]。Dror等[14]報道，由黑色素瘤細胞分泌并被成纖維細胞吸收的黑素體miR-211可激活促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，并誘導(dǎo)NFs重編程為CAFs。此外，黑色素瘤細胞釋放的外泌體miR-155可以促進NFs中CAFs特異性活化標志物α-平滑肌肌動蛋白和成纖維細胞活化蛋白的表達[15]。由此可見，黑色素瘤細胞主要以旁分泌形式影響NFs的表觀遺傳，并使其活化成為CAFs。

2 CAFs促進黑色素瘤的生長

各種體內(nèi)外模型已證實CAFs對黑色素瘤生長的促進作用。如白細胞介素-6、白細胞介素-8、CXC趨化因子配體1、胰島素樣生長因子2、成纖維細胞生長因子7和轉(zhuǎn)化生長因子-β3等參與了CAFs與黑色素瘤細胞之間的交互作用，上述細胞因子參與免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)炎癥發(fā)生、刺激黑色素瘤生長[3,10]。使用腫瘤異種移植模型對黑色素瘤進行研究發(fā)現(xiàn)，與NFs相比，CAFs能顯著促進與其共注射的黑色素瘤細胞的生長，并可過度表達成纖維細胞活化蛋白，導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤環(huán)境的產(chǎn)生[16]。因此，調(diào)節(jié)CAFs促進黑色素瘤生長的分子機制受到人們的關(guān)注。

在原位皮膚癌模型中，皮膚成纖維細胞中雄激素受體表達的下調(diào)能誘導(dǎo)CAFs活化的早期步驟，并增強黑色素瘤細胞的致瘤性。雄激素受體能抑制CAFs效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄過程，進而抑制腫瘤生長[17]。在軟瓊脂集落形成試驗中，CAFs通過產(chǎn)生可溶性因子支持黑色素瘤細胞的生長；當阻斷CAFs中的β聯(lián)蛋白信號時，B-Raf激酶活化的同源性磷酸酶及張力蛋白可顯著抑制缺陷小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長。由β聯(lián)蛋白消融導(dǎo)致的死亡CAFs可以釋放促凋亡或生長抑制因子，從而誘導(dǎo)黑色素瘤細胞的細胞周期停滯和凋亡[16]。因此，皮膚成纖維細胞中的雄激素受體和β聯(lián)蛋白在調(diào)控CAFs促進黑色素瘤生長的信號通路中均發(fā)揮重要作用。

3 CAFs有助于黑色素瘤致密結(jié)構(gòu)的形成和耐藥

黑色素瘤細胞主動募集成纖維細胞并刺激其分泌ECM，進而促進ECM的運動。在結(jié)構(gòu)上，與僅存在黑色素瘤細胞的瘤體相比，黑色素瘤細胞與CAFs形成的共培養(yǎng)瘤體更小、更緊湊、更有條理。CAFs促成黑色素瘤致密結(jié)構(gòu)形成的大致過程為：病程早期，發(fā)病部位只存在少量的游離黑色素瘤細胞和成纖維細胞。隨后，黑色素瘤細胞刺激成纖維細胞，使其獲得功能過度活化的特征，形成CAFs。除增殖性和運動性增強外，CAFs還釋放了更多的生長因子和蛋白酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶)，并增加ECM蛋白(如纖維粘連蛋白、肌腱蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白Ⅳ等)的表達，從而獲得強大的ECM生物合成和沉積能力。隨后，游離的黑色素瘤細胞遷移到ECM中穩(wěn)定下來，形成固定的黑色素瘤細胞，并分裂產(chǎn)生新的游離黑色素瘤細胞。在分裂的過程中，固定癌細胞會在空間上進行自我封閉，最終形成封閉的隔室[3-5,10]。因此，實體瘤致密、纖維化的本質(zhì)被認為是成纖維細胞浸潤和ECM蛋白沉積的直接結(jié)果，這一結(jié)果可以防止治療性藥物到達黑色素瘤組織核心的黑色素瘤細胞處，從而促成腫瘤的耐藥性。

4 CAFs協(xié)助黑色素瘤進行上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程

在黑色素瘤中，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)表現(xiàn)為從上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂泄δ苄蚤g充質(zhì)表型的惡性黑素細胞，這一過程被認為具有驅(qū)動黑色素瘤細胞獲得轉(zhuǎn)移潛能和侵襲性質(zhì)的作用。EMT的重要標志包括上皮鈣黏素表達的下調(diào)和神經(jīng)鈣黏素表達的增加。正常黑素細胞存在于靠近基膜的表皮中，形成表皮黑色素單元，其中含有一個黑素細胞和多達36個角質(zhì)形成細胞。正常生理情況下，由于上皮鈣黏素的表達，黑素細胞黏附于角質(zhì)形成細胞，導(dǎo)致黑素細胞生長、樹突形成和黑色素瘤相關(guān)細胞表面分子的表達受限。隨著黑素細胞的突變，惡性黑色素瘤細胞的增殖速度加快，且上皮鈣黏素的表達向神經(jīng)鈣黏素轉(zhuǎn)換。不同類型黏附分子間的表達轉(zhuǎn)換導(dǎo)致黑色素瘤細胞與鄰近角質(zhì)形成細胞之間失去接觸，并與表達神經(jīng)鈣黏素的CAFs相結(jié)合，促使黑色素瘤細胞遠離角質(zhì)形成細胞并侵入下方真皮，通過血液系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)遷移至遠處組織，并建立轉(zhuǎn)移[3,5,18]。

除上皮鈣黏素和神經(jīng)鈣黏素外，其他的EMT標志物(Snail1、Snail2、鋅指E盒結(jié)合蛋白1、鋅指E盒結(jié)合蛋白2、Twist和Claudin-1等)也在黑色素瘤的EMT過程中發(fā)揮了重要作用。通過上調(diào)上皮標志物(上皮鈣黏素)和下調(diào)間充質(zhì)標志物(鋅指E盒結(jié)合蛋白1和鋅指E盒結(jié)合蛋白2)顯示，CAFs失活后，黑色素瘤細胞中的EMT過程受阻[16]。細胞極性的喪失是EMT過程的關(guān)鍵，而緊密連接蛋白Claudin-1積極參與維持上皮細胞的頂端-基底極性，因此，CAFs失活后Claudin-1表達增加進一步證明CAFs促進了EMT過程。此外，阻斷CAFs中β聯(lián)蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后，黑色素瘤細胞中鋅指E盒結(jié)合蛋白1和Snail的表達下調(diào)，且與Claudin-1表達增加相關(guān)[16,19]。可見，β聯(lián)蛋白不僅在CAFs促進黑色素瘤生長中十分關(guān)鍵，而且在EMT過程中也發(fā)揮重要作用。

5 CAFs與黑色素瘤通過相互作用促進腫瘤血管生成

黑色素瘤是高度血管化的腫瘤，因為CAFs可通過分泌一些促血管生成因子作用于黑色素瘤，以促進腫瘤血管生成，如血管內(nèi)皮生長因子A、成纖維細胞生長因子2以及基質(zhì)金屬蛋白酶等蛋白水解酶[15,20]。血管內(nèi)皮生長因子A和成纖維細胞生長因子2可與血管內(nèi)皮細胞結(jié)合并激活各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游，從而促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、擴散和遷移[15]。CAFs分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶13可通過釋放ECM中的血管內(nèi)皮生長因子促進腫瘤血管生成，從而增加鱗狀細胞癌或黑色素瘤的侵襲[21]；而CAFs分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶9是一種促血管生成的ECM重構(gòu)酶，能幫助重建ECM，以促進血管內(nèi)皮細胞穿過ECM構(gòu)成的結(jié)構(gòu)屏障[15]。

另一方面，黑色素瘤也通過旁分泌方式加強CAFs的促腫瘤血管生成作用。如結(jié)締組織生長因子可由CAFs表達，并在黑色素瘤中過表達，能誘導(dǎo)基質(zhì)和腫瘤中CAFs的活化，并進一步導(dǎo)致內(nèi)皮標志物CD31/血小板內(nèi)皮細胞黏附分子的表達水平升高，最終增加腫瘤血管的體積[22]。此外，黑色素瘤細胞分泌的外泌體miR-155可以直接傳遞到成纖維細胞中，誘導(dǎo)CAFs的形成并抑制細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子1的表達[15]。細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子1表達的抑制會導(dǎo)致Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路的激活以及血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的過度表達，觸發(fā)CAFs的促血管生成作用[15,23]。

6 CAFs誘導(dǎo)黑色素瘤轉(zhuǎn)移并參與轉(zhuǎn)移前龕的形成

活化的CAFs在黑色素瘤的轉(zhuǎn)移過程中不可或缺，是轉(zhuǎn)移病變形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。CAFs分泌的分泌型卷曲相關(guān)蛋白2能激活黑色素瘤細胞中的多步信號級聯(lián)，導(dǎo)致β聯(lián)蛋白和小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的減少，最終使腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移增加[24]。同時，CAFs還可以通過影響原發(fā)腫瘤ECM的硬度增強黑色素瘤細胞的侵襲，并可能產(chǎn)生ECM軌跡，以指導(dǎo)黑色素瘤細胞的侵襲[25-27]。

另外，在黑色素瘤遠處轉(zhuǎn)移過程中，CAFs參與了轉(zhuǎn)移前龕的形成，并介導(dǎo)了轉(zhuǎn)移部位繼發(fā)性腫瘤的生長。轉(zhuǎn)移前龕是可能發(fā)生腫瘤繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的部位所形成的微環(huán)境，主要由CAFs、浸潤性免疫細胞、內(nèi)皮細胞等組成。轉(zhuǎn)移前龕必須創(chuàng)造一個支持性微環(huán)境，以便經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達此處的惡性腫瘤細胞駐留、生長和建立第二個腫瘤[28-30]。在黑色素瘤中，CAFs參與了轉(zhuǎn)移前龕的形成，并通過與腫瘤微環(huán)境和轉(zhuǎn)移前龕中不同類型細胞的相互作用介導(dǎo)各種促進腫瘤轉(zhuǎn)移的過程[31]。首先，黑色素瘤原發(fā)部位的CAFs可通過釋放生長因子和細胞因子來增強轉(zhuǎn)移，直接或間接刺激遠處轉(zhuǎn)移位點中黑色素瘤細胞的生長和侵襲[5,32]。對自發(fā)性黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型的研究顯示，成纖維細胞在黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移微環(huán)境中被激活為CAFs：由轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞分泌的外泌體在肺成纖維細胞中激發(fā)肺成纖維細胞的活化，進而引發(fā)CAFs促炎基因的表達，發(fā)揮促炎功能[31]。轉(zhuǎn)移到肝臟的黑色素瘤則依賴于肝星狀細胞(肝臟駐留成纖維細胞)激活形成CAFs來支持腫瘤血管的生成[33]。

7 小 結(jié)

黑色素瘤細胞通過分泌各種化學(xué)因子、細胞外囊泡等誘導(dǎo)正常成纖維細胞活化成為CAFs；同時，CAFs也反過來直接或間接地影響黑色素瘤的進展，兩者之間的相互作用機制可以為黑色素瘤治療提供新思路：CAFs表達的結(jié)締組織生長因子對于B-Raf激酶抑制性抵抗的黑色素瘤可能是一個新的治療靶點；引發(fā)CAFs促血管生成啟動的外泌體，miR-155可成為黑色素瘤抗血管生成療法的潛在靶標；以黑色素瘤細胞和CAFs為共同目標的組合治療有希望成為克服治療抗性的新策略。在黑色素瘤細胞分泌的細胞外囊泡中，除miRNA外，其他組分對促進CAFs形成的作用，以及CAFs在黑色素瘤免疫逃逸中發(fā)揮的作用，仍需要進一步研究的證實。