鈣黏素亞型2在干細(xì)胞分化中的作用

柳 鑫 臧春逸

細(xì)胞間粘連可以調(diào)控單一細(xì)胞進(jìn)一步合成組織，在組織結(jié)構(gòu)與形態(tài)發(fā)生中起重要作用。細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與間質(zhì)間的相互作用通過細(xì)胞粘連分子(cell adhesion molecules,CAMs)來調(diào)節(jié)。這些細(xì)胞粘連分子包括鈣黏素、整聯(lián)蛋白、選擇蛋白和免疫球蛋白樣CAMs。細(xì)胞與細(xì)胞或與間質(zhì)間的相互作用可調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為，如：增生、分化、凋亡、細(xì)胞極化，總體來說其目的是保持組織的完整[1，2]。

鈣黏素亞型2(cadherin-2，CDH2)是一種鈣離子依賴跨膜糖蛋白，是粘連蛋白家族中的一員。它的作用是通過形成粘連帶(adherens junctions,AJ)來調(diào)節(jié)鈣離子依賴的親同種抗原的細(xì)胞間的相互作用。細(xì)胞在不同狀態(tài)下鈣黏素的表達(dá)水平也不同，尤其當(dāng)細(xì)胞從一種狀態(tài)向另一種狀態(tài)轉(zhuǎn)換時，例如上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換表現(xiàn)為CDH2過表達(dá)。鈣黏素的表達(dá)與細(xì)胞間的粘連在干細(xì)胞分化或成熟細(xì)胞向多潛能細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中起作用[3，4]。

干細(xì)胞分化受局部微環(huán)境中可溶性及非可溶性信號的影響。除了可溶性生長因子，許多精煉的研究中還牽扯到細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用以及干細(xì)胞譜系分化傳遞的底物動力學(xué)[5]。粘連帶在胚胎干細(xì)胞再生、細(xì)胞重組、造血干細(xì)胞植入和間充質(zhì)干細(xì)胞分化成肌肉過程中均起作用[6，7]。對CDH2在干細(xì)胞分化中的作用進(jìn)行介紹，旨在其對指導(dǎo)控制干細(xì)胞分化的新技術(shù)的產(chǎn)生與設(shè)計出納米仿生材料，并將其應(yīng)用于組織工程與再生醫(yī)學(xué)方面有潛在價值。

一、粘連帶：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與機(jī)械感應(yīng)

CDH2包含細(xì)胞質(zhì)區(qū)域和外功能區(qū)，外功能區(qū)包含5個串聯(lián)的細(xì)胞外鈣黏著蛋白(EC)區(qū)域[8]。EC區(qū)域包含鈣離子結(jié)合位點，3個鈣離子作為區(qū)域間的連接者，可穩(wěn)定外功能區(qū)的結(jié)構(gòu)，保護(hù)它不被蛋白水解。最外層的EC1區(qū)域調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞間鈣黏著蛋白間的相互作用，進(jìn)而在平行且相反的細(xì)胞膜間行成粘連帶[9]。CDH2特定地在間充質(zhì)類的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞上表達(dá)，并調(diào)節(jié)相同細(xì)胞間粘連，如肌成纖維細(xì)胞，或不同類型細(xì)胞間的粘連，如肌成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞[10]。

鈣黏著蛋白間的作用會通過板盤突出啟動開始，并引起細(xì)胞間通路的激活，最終形成鈣黏著蛋白間肌動蛋白簇。鈣黏著蛋白間的聯(lián)系促進(jìn)粘連帶的形成并穩(wěn)固粘連帶。而肌動蛋白聚集會使粘連帶擴(kuò)張與成熟，進(jìn)一步穩(wěn)固并矯正相鄰細(xì)胞膜。另外，b鈣黏著蛋白與鈣黏著蛋白細(xì)胞質(zhì)尾部相結(jié)合并作用于a鈣黏著蛋白，來調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架[11]。鈣黏著蛋白細(xì)胞內(nèi)的區(qū)域與P120鈣黏著蛋白結(jié)合，使鈣黏著蛋白與微管相連，并調(diào)節(jié)GTP酶Rho、Rac1、Cdc42。擾亂Rac或Rho活性會影響AJ合成，Cdc42則會影響AJ穩(wěn)定[11]。GTP酶的功能是與鈣黏素相連進(jìn)而控制不同的細(xì)胞活動包括極化、遷移、凋亡[12]。CDH2通過p120與b鈣黏著蛋白依賴信號通路來調(diào)節(jié)極化信號。CDH2調(diào)節(jié)的細(xì)胞粘連對于組織整體的遷移是重要的。

研究表明鈣黏素受生長因子的影響，并與生長因子受體相作用進(jìn)而激活信號通路。當(dāng)暴露于切斷應(yīng)激環(huán)境，上皮鈣黏著蛋白與血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘連分子(PECAM-1)和血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR2)結(jié)合，這一復(fù)合體會引起整聯(lián)蛋白激活，致使肌動蛋白細(xì)胞骨架重組[13]。在上皮細(xì)胞，表皮生長因子受體(EGFR)與CDH1行成復(fù)合體進(jìn)而激活MAPK通路，進(jìn)而與細(xì)胞生存或EMT相關(guān)[14]。成纖維細(xì)胞受體(FGFRs)在神經(jīng)突生長時可以刺激CDH2、FGF通過加強(qiáng)穩(wěn)固在AJ位點的上皮鈣黏素對于保持血管的完整性起重要作用[15]。肝細(xì)胞生長因子(HGF)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘連分子上皮-鈣黏著蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞的活性、遷移與血管再生。最后，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)可以通過提高CDH2水平增加角化細(xì)胞遷移，而這一作用可以被EGF抵消[16]。

多項研究表明，鈣黏素不僅受化學(xué)因素調(diào)控也受物理因素調(diào)控。近年來研究表明，底物強(qiáng)直可以通過c-jun氨基端激酶(JNK)磷酸化水平在培養(yǎng)基及在體內(nèi)或體外的表皮組織中調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間AJ的形成[17]。強(qiáng)直的底物導(dǎo)致JNK激活和AJ消失，而柔軟的矩陣抑制JNK活性導(dǎo)致AJ合成。這一結(jié)論在生物工程表皮與(jnk1-/-或jnk2-/-)敲除鼠表皮中已得到驗證。由此得出結(jié)論，JNK通路所調(diào)節(jié)的底物的僵硬度在體內(nèi)外均有影響AJ合成的效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)可以幫助理解在組織發(fā)育過程中AJ的形成與消除的機(jī)制，也可以在三維水平上通過控制細(xì)胞間與細(xì)胞與底物間粘連，從而發(fā)現(xiàn)促進(jìn)組織再生或抑制腫瘤浸潤的治療策略。

眾所周知底物僵直可以影響焦點粘連，另有實驗證實它也可以影響鈣黏素調(diào)節(jié)的細(xì)胞間粘連。通過肌動蛋白收縮，底物僵直可以影響依賴鈣黏素的整體細(xì)胞遷移。CDH2被看作是一種機(jī)械反應(yīng)的受體，當(dāng)壓力通過CDH2傳導(dǎo)，粘連帶的作用與整聯(lián)蛋白-ECM復(fù)合體的支撐作用是相同的?？傮w說來，僵硬的底物可以造成較大的牽引力，較大的細(xì)胞播散區(qū)，生成更多的CDH2連接帶[18]。

最后，了解以鈣黏素為基礎(chǔ)的細(xì)胞間的相互作用對于發(fā)展無支架組織工程相關(guān)的新型治療方案是有幫助的。這些新的治療方案基于細(xì)胞應(yīng)用無支架技術(shù)如形成球體或生物打印進(jìn)行自我合成，進(jìn)而形成有結(jié)構(gòu)的組織[19]。

二、CDH2在間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的作用

鈣黏素可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞穩(wěn)定性及分化。間充質(zhì)干細(xì)胞為治療骨與軟骨類疾病、心肌梗死、腦卒中、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷、器官移植疾病、皮膚移植排斥等提供細(xì)胞治療的細(xì)胞來源[20～22]。間充質(zhì)干細(xì)胞在組織修復(fù)中發(fā)揮作用需要遷移到組織損傷的部位，研究證實多種細(xì)胞的遷移與增生的潛能要受CDH2調(diào)節(jié)。間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化潛能和抗炎作用。當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)成球體時它的分化潛能與抗炎作用會加強(qiáng)[23]。CDH2對于在關(guān)節(jié)滑液中成纖維細(xì)胞面對炎癥時起作用是至關(guān)重要的，CDH2在肌源性細(xì)胞分化過程中起重要作用。細(xì)胞密度大可以促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，提示鈣黏素調(diào)節(jié)的細(xì)胞間接觸可以影響肌肉生成。CDH2在創(chuàng)傷愈合中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起重要作用，可以增加創(chuàng)面的收縮促進(jìn)創(chuàng)面閉合[24]。

CDH2在干細(xì)胞分化中起重要作用，因此可以挖掘細(xì)胞間的作用來控制干細(xì)胞分化的技術(shù)。包括以下兩方面內(nèi)容：①鈣黏著蛋白表面工程控制干細(xì)胞分化；②表面微拓?fù)涔こ炭刂萍?xì)胞間粘連的范圍和信號。

1.鈣黏著蛋白表面工程控制干細(xì)胞分化：當(dāng)CDH1在上皮細(xì)胞中聚集時，固定的鈣黏素會誘發(fā)信號發(fā)生瀑布反應(yīng)。鈣黏素與Fc抗體結(jié)合生成融合蛋白可以使鈣黏素固定到細(xì)胞表面。另外，為了生成有功能的表面物質(zhì)，固定的鈣黏素可以把其他連接蛋白激活的通路與鈣黏素調(diào)節(jié)的信號通路分開。鈣黏素調(diào)節(jié)的連接蛋白激活的通路結(jié)果是在細(xì)胞間接觸過程中生成AJ[25]。

CDH2與Fc結(jié)合形成的固定融合蛋白保留了CDH2本身的粘連特性，使β-聯(lián)蛋白、α-聯(lián)蛋白和P120在細(xì)胞間接觸部位聚集。成肌調(diào)節(jié)因子SRF表達(dá)升高可以證明CDH2-Fc結(jié)合形成的球形蛋白使成肌細(xì)胞成熟。在脂肪雙層細(xì)胞膜中的CDH2可以誘導(dǎo)骨軟骨前體中的間質(zhì)細(xì)胞凝集[26]。有研究證實固定的鈣黏素以劑量依賴的方式促進(jìn)MSC分化成SMC。所以可以通過改變表面物質(zhì)的構(gòu)成與細(xì)胞密度控制干細(xì)胞分化。因此，鈣黏素制動可以指導(dǎo)或調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化，可以在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中利用這一作用機(jī)制制造有功能的生物材料。

2.細(xì)胞表面微拓?fù)涔こ炭刂萍?xì)胞間粘連范圍與信號轉(zhuǎn)導(dǎo):微細(xì)加工技術(shù)使得在微米與納米水平控制細(xì)胞間粘連范圍成為可能。這種方法在控制細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用方面得到廣泛應(yīng)用，而細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用對于干細(xì)胞分化是至關(guān)重要的。鮮有研究應(yīng)用幾何微圖形來控制細(xì)胞間粘連，并評價細(xì)胞間粘連對干細(xì)胞分化的影響[27]。

有研究表明微島的大小與細(xì)胞分散的程度密切相關(guān)，在較大的島上，CDH2的表達(dá)可以引起間充質(zhì)干細(xì)胞向肌源性或軟管源性細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而在小島上則向脂源性細(xì)胞轉(zhuǎn)化。通過控制微島的幾何形狀與大小，細(xì)胞間接觸會增加，進(jìn)而增加了軟骨源性細(xì)胞的分化[28]。然而控制細(xì)胞間的作用除了考慮微圖形的大小還要考慮細(xì)胞的密度。因此，細(xì)胞分散程度會隨細(xì)胞島大小改變而變化。所以，細(xì)胞間作用對細(xì)胞與底物間粘連的影響相矛盾，使得調(diào)節(jié)它們間的作用具有挑戰(zhàn)性。一些新的幾何形狀已被用來控制細(xì)胞間接觸的范圍，而不需考慮細(xì)胞密度或細(xì)胞分散區(qū)域[29]。因此可以用來確定細(xì)胞間粘連范圍與干細(xì)胞分化的關(guān)系。

三、實時監(jiān)控細(xì)胞間粘連所調(diào)節(jié)的干細(xì)胞分化

理解細(xì)胞間粘連如何影響干細(xì)胞分化需要找到實時量化監(jiān)測干細(xì)胞分化的方法。尤其是監(jiān)測微圖形表面的單個小細(xì)胞的方法是非常有用的。另外，監(jiān)測單個細(xì)胞技術(shù)在處理胚胎異質(zhì)性、誘導(dǎo)干細(xì)胞多能性、成人干細(xì)胞相關(guān)研究上非常有價值，同樣對于區(qū)分不同分化潛能的細(xì)胞是有幫助的。

慢病毒排列技術(shù)可以監(jiān)測在干細(xì)胞分化過程中的激活的基因或通路。新型慢病毒雙重促進(jìn)質(zhì)粒(LVDP)，可以定量測量一種基因促進(jìn)因子(Pr)的活性，或轉(zhuǎn)錄因子(TF)結(jié)合部位(反應(yīng)原件，RE)，而無需考慮每一個細(xì)胞中基因的數(shù)量。二代慢病毒質(zhì)粒(shLVDP)可以通過在多環(huán)西素中敲除伴隨基因的辦法來實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測Pr或RE活性，由此發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞分化過程中涉及的基因[30]。除此之外，在聚合反應(yīng)中慢病毒粒子的表面可以設(shè)計成以共價鍵的方式與纖維素水凝膠結(jié)合，進(jìn)而生成慢病毒排列，可以測量多種參與炎性反應(yīng)中Pr或RE的活性。近年來，筆者發(fā)現(xiàn)了一系列Pr或RE庫來監(jiān)測干細(xì)胞向脂源性、軟骨源性或肌源性分化過程，并識別出在分化中的新的通路[30]。這一技術(shù)與新的微細(xì)加工方法可以確定細(xì)胞間粘連程度是如何影響成人干細(xì)胞分化，腫瘤干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)分化，還有如何影響對于細(xì)胞重組有重要作用的干細(xì)胞多潛能性網(wǎng)絡(luò)。

四、展 望

盡管一些研究聚焦于底物僵直對干細(xì)胞生物學(xué)的影響，細(xì)胞間粘連在引導(dǎo)干細(xì)胞再生或分化中的作用還是不清楚的。此篇聚焦于CDH2作為干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子作用。需要更多的研究來闡明細(xì)胞間粘連如何影響間充質(zhì)分化，進(jìn)而了解哪些分子通路參與其中。這些研究也將通過調(diào)節(jié)鈣黏素調(diào)控的粘連范圍，設(shè)計出能夠引導(dǎo)間充質(zhì)分化的產(chǎn)品，將其應(yīng)用于組織工程或再生醫(yī)學(xué)。筆者所在團(tuán)隊通過進(jìn)行子宮內(nèi)膜瘢痕組織與正常子宮內(nèi)膜的基因芯片與microRNA芯片檢測，篩選出在子宮內(nèi)膜瘢痕組織中CDH2顯著高表達(dá)，且子宮內(nèi)膜損傷越嚴(yán)重，CDH2的表達(dá)水平越高，提示CDH2在子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)過程中，可能存在CDH2通過調(diào)節(jié)相關(guān)分子通路使得子宮內(nèi)膜間充質(zhì)細(xì)胞分化成肌肉組織，形成宮腔粘連帶即子宮瘢痕。CDH2的上游靶向負(fù)調(diào)控microRNA為miRNA543,設(shè)想當(dāng)子宮內(nèi)膜面臨損傷時轉(zhuǎn)染miRNA543會使得CDH2表達(dá)下降，從而間充質(zhì)細(xì)胞分化成肌肉組織減少，即瘢痕組織減少，減少對宮腔形態(tài)的影響以及對子宮肌層收縮的功能影響，從而改善致病因素對子宮內(nèi)膜損傷的結(jié)局。最終期望通過對CDH2功能的研究，或許可以幫助設(shè)計出改善子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)結(jié)局的產(chǎn)品，應(yīng)用于子宮內(nèi)膜損傷的患者中，幫助患者保留子宮的生殖及生理功能。