初探BRAFV600E免疫組化在甲狀腺乳頭狀癌中的應(yīng)用

羅昊，劉艷麗，刁國(guó)慶，吳敏，劉東，劉鑫

（北京市昌平區(qū)醫(yī)院 病理科，北京 102200）

0 引言

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，據(jù)北京市2015年癌癥播報(bào)數(shù)據(jù)顯示甲狀腺癌已上升為女性癌癥發(fā)病率的第三順位。近年研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌與BRAF基因突變有密切關(guān)系，尤其是BRAF第600位纈氨酸（V）向谷氨酸（E）的突變，研究數(shù)據(jù)表明甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E突變率高達(dá)29%-83%[1-3]，被認(rèn)為是甲狀腺乳頭狀癌不良預(yù)后因素。但目前的主流研究BRAFV600E突變的方法主要為DNA測(cè)序以及基于PCR的各種分子生物學(xué)方法等，這些分子生物學(xué)檢測(cè)需要專(zhuān)業(yè)的操作人員而且實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)成本高和周期長(zhǎng)，價(jià)格較高，病人花費(fèi)較多，不利于 BRAFV600E突變的檢測(cè)和應(yīng)用。本文擬通過(guò)免疫組化法檢測(cè)BRAFV600E突變蛋白PTC中的表達(dá)分析，探討免疫組化法檢測(cè)BrafV600E突變的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料。收集2016年8月至2018年8月昌平區(qū)醫(yī)院病理科接收60例甲狀腺病變手術(shù)切除標(biāo)本。其中PTC組49例，男女比例1:3，患者年齡28-76歲；其中微小甲狀腺乳頭狀癌（直徑＜1.0 cm）35例；10例有區(qū)域淋巴結(jié)清掃病例中僅3例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；PTC組中經(jīng)典型PTC47例，濾泡亞型2例（包括其中一例為包裹型濾泡亞型）。其他良性病變共10例。PTC組中1例經(jīng)PCR檢測(cè)證實(shí)BRAFV600E陽(yáng)性病例作為陽(yáng)性對(duì)照，另取1例濾泡癌，1例皮膚組織作為陰性對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法。所有染色組織選自非冰凍組織蠟塊，切片厚度4 μm，經(jīng)烤箱70度烤30 min。其后使用羅氏診斷BRAF V600E（VE1）抗體檢測(cè)試劑盒（英文名：VENTANA anti-BRAF V600E（VE1） Mouse Monoclonal Primary Antibody，購(gòu)于北京巴瑞試劑公司），并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在本塔納標(biāo)準(zhǔn)全自動(dòng)染色平臺(tái)上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。染色結(jié)果由兩位高級(jí)職稱(chēng)醫(yī)師觀察評(píng)判，當(dāng)腫瘤細(xì)胞漿的出現(xiàn)染色被認(rèn)為是正確的染色部位；但腫瘤細(xì)胞僅有散在、微弱陽(yáng)性判讀為BRAFV600E突變蛋白陰性；當(dāng)大于85%的腫瘤細(xì)胞漿出現(xiàn)中等強(qiáng)度以上染色則判讀為BRAFV600E突變蛋白陽(yáng)性[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本文中所有數(shù)據(jù)SSPS 21.0軟件做χ2檢驗(yàn)分析，當(dāng)P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAFV600E免疫組化結(jié)果

2.1.1 PTC與非癌組織的結(jié)果對(duì)比：49例甲狀腺乳頭狀癌組中其中1例由于腫瘤組織太少，免疫組化切片上已無(wú)腫瘤組織，因此從PTC組剔除，PTC組最終剩余48例病例數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)研究。48例PTC組中有38例表達(dá)BRAFV600E突變蛋白陽(yáng)性，總陽(yáng)性表達(dá)率為（38/48）79.1%而甲狀腺非腫瘤組BrafV600E突變蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為0，（χ2=19.59，P＜0.01）兩組差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.2 相關(guān)臨床特征分組之間的差別：將48例PTC按照性別、年齡（＞45，≤45）、腫瘤大?。ā? cm，小于1 cm）、腫瘤有無(wú)包膜侵犯等分組分析BrafV600E突變蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示各組之間差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。另由于本組數(shù)據(jù)中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少未做統(tǒng)計(jì)，3例有轉(zhuǎn)移癌淋巴結(jié)病例中兩例BRAFV600E陽(yáng)性，1例由于組織飛片無(wú)法判斷。

3 討論

隨著B(niǎo)RAFV600E突變蛋白單抗VE1 的誕生，免疫組化檢測(cè)BRAFV600E突變也應(yīng)運(yùn)而生，雖然Dan Chen等的研究中發(fā)現(xiàn)2例IHC陽(yáng)性而PCR陰性病例，認(rèn)為IHC可能存在少量假陽(yáng)性[5]，但多項(xiàng)研究表明BRAF V600E免疫組化在組織中檢測(cè)的結(jié)果與PCR等檢測(cè)方法結(jié)果相比較都有較好的一致性[6-7]。本研究組中48例甲狀腺乳頭狀癌組中有38例BRAF V600E陽(yáng)性，總體的陽(yáng)性率79.2%。結(jié)果與Jung-Soo等一項(xiàng)包含不同國(guó)家11篇文章的1141病例的meta分析中得出甲狀腺乳頭狀癌中BRAF V600E免疫組化檢測(cè)的總體陽(yáng)性率79.1%[6]相符，因此可見(jiàn)免疫組化法有較高的可靠性和穩(wěn)定的。

表1 兩組患者相關(guān)臨床特征對(duì)比

當(dāng)前關(guān)于BRAF V600E突變與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理關(guān)系，研究結(jié)論仍不一致，部分研究認(rèn)為BRAFV600E突變與患者年齡，腫瘤大小，生長(zhǎng)方式，腫瘤分型，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)[8-9]而有些研究認(rèn)為BRAF V600E突變僅僅與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與其他臨床信息均無(wú)關(guān)系[4]本研究中也得到類(lèi)似結(jié)果。筆者推測(cè)多項(xiàng)研究的不一致性可能由于樣本量和人群以及研究方法之間的差異所致，但同時(shí)可能提示BRAFV600E突變并非與某項(xiàng)臨床病理信息存在確定相關(guān)性，而只是腫瘤發(fā)生相關(guān)的一種分子機(jī)制。同時(shí)，我們已知甲狀腺乳頭狀癌生物學(xué)性質(zhì)相對(duì)溫和，雖然其區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率可達(dá)20%-60%[10]，尤其是經(jīng)典的甲狀腺乳頭狀癌病例中，但是僅有10%-15%的病例會(huì)表現(xiàn)為侵襲發(fā)展的行為，與當(dāng)前甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E高達(dá)29%-83%的突變率存在一定差異。因此推測(cè)BRAFV600E突變可能是腫瘤發(fā)生相關(guān)的一種分子機(jī)制，是影響甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后的一個(gè)因素，但并非唯一的關(guān)鍵因素。關(guān)于BRAFV600E突變對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌的更大的意義可能在于其相關(guān)分子藥物靶向治療，而非不良預(yù)后的預(yù)測(cè)上。因此改用成本較低、易操作的免疫組化方法有助于BRAFV600E突變檢測(cè)推廣，從而使更多患者受益。

當(dāng)然，由于當(dāng)前免疫組化的方法運(yùn)用并不廣泛，對(duì)BRAFV600E突變的免疫組化結(jié)果仍缺乏統(tǒng)一的判讀標(biāo)準(zhǔn)[11]。一些研究者認(rèn)為腫瘤細(xì)胞漿中出現(xiàn)中-強(qiáng)度的染色即確定為陽(yáng)性[5-9]，未對(duì)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性的數(shù)量并未提出要求；而Fisher等認(rèn)為只有＞10%腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)中度-強(qiáng)度的陽(yáng)性才能判讀為陽(yáng)性[12]。其他一些學(xué)者則認(rèn)為彌漫＞85%腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)明確染色可以判讀為陽(yáng)性[4]，因此建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)的判讀標(biāo)準(zhǔn)，是推廣BRAFV600E免疫組化作為初篩方法的首要問(wèn)題。

綜上所述，BRAFV600E免疫組化以其較高的可靠性和簡(jiǎn)便快捷，易操作，花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)可作為初步鑒別診斷手段以便廣泛運(yùn)用于甲狀腺乳頭狀癌組織及細(xì)胞學(xué)診斷中。其次建立規(guī)范的BRAFV600E免疫組化的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，研究和確立類(lèi)似于乳腺、胃的關(guān)于HER-2檢測(cè)與治療相關(guān)性的系列關(guān)系，可能是未來(lái)研究BRAFV600E突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌患者個(gè)性化治療中的作用的關(guān)鍵問(wèn)題。