類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血NK細胞TIGIT表達及意義

肖鵬程，羅 清

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種累及全身多個組織器官的慢性系統(tǒng)性自身免疫病，其主要臨床特點是反復、對稱的小關(guān)節(jié)病變，最終可導致關(guān)節(jié)功能障礙及畸形[1]。雖然RA的病因及致病機制至今未明，但已有資料證明自然殺傷(natural killer, NK)細胞參與的免疫調(diào)節(jié)在RA的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[2-5]。近年來，共刺激分子在RA疾病進展中的作用受到普遍關(guān)注[6]。負性共刺激分子T細胞免疫球蛋白及免疫酪氨酸樣抑制基序(T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory domains,TIGIT) 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑制性Ⅰ型跨膜糖蛋白分子，主要表達于NK細胞和T細胞，通過與配體PVR(poliovirus receptor. CD155)等相互作用，負向調(diào)控機體免疫應答。已有研究證實T細胞上TIGIT的表達與RA致病有關(guān)[7-8]。目前，關(guān)于RA患者外周血中NK細胞上TIGIT的表達以及臨床意義鮮有報道。該研究擬探討TIGIT在RA中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2016年8月～2017年8月南昌大學第一附屬醫(yī)院收治的RA患者33例，年齡17～81(58.2±15.2)歲，其中女性22例，男性11例。所有入選的RA患者均符合1987年美國風濕病學會(ACR)制定的RA診斷標準[9]，并除外其他自身免疫性疾病、腫瘤等嚴重疾病。根據(jù)RA疾病活動性評分(disease activity score 28, DAS28)[10]對RA患者病情的嚴重程度進行評估。此外，根據(jù)RA患者病程的長短(是否超過6個月)分為兩組，分別為新發(fā)病例組(7例)和復發(fā)病例組(26例)[11]。對照者27例，為同時間段年齡和性別相匹配的健康體檢者，年齡24～84(53.0±20.4)歲，其中女性18例，男性9例。本研究通過該院倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 主要試劑與儀器流式抗體PC7-CD56、ECD-CD3和PE-IgGl購自美國Beckman Coulter公司；PE-TIGIT購自美國eBioscience公司；Ficoll-Paque 分離液購自美國Sigma公司；抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrylinated peptide , CCP)檢測試劑盒購自上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司；類風濕因子(rheumatoid factor, RF)和C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)檢測試劑盒購自美國Beckman Coulter公司。流式細胞儀Cytomics FC 500及其相關(guān)的CXP分析系統(tǒng)均購自美國Beckman Coulter公司；動態(tài)血沉儀購自北京普利生公司；特定蛋白儀IMMAGE800購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1標本收集及處理 采集EDTA抗凝空腹靜脈血5 ml，6 h內(nèi)采用Ficoll-Paque 分離液按照常規(guī)方法分離提取RA患者和對照者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。

1.3.2流式細胞分析 提取獲得各研究對象的PBMC后，用100 μl生理鹽水重懸的PBMC加入2只試管中，按以下組合加入流式抗體各10 μl: PC7-CD56、ECD-CD3、PE-IgGl；PC7-CD56、ECD-CD3、PE-TIGIT，再按照流式檢測的作業(yè)指導書檢測RA患者和對照者NK細胞數(shù)量和NK細胞上TIGIT的表達情況。

1.3.3實驗室指標測定 分別采用動態(tài)血沉儀法、酶聯(lián)免疫吸附法和速率散色比濁法檢測血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、CCP、RF和 CRP等指標。

1.4 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)性分布分別采用t檢驗或 Mann-WhitneyU檢驗。線性相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析(兩變量為正態(tài)分布數(shù)據(jù))或Spearman 相關(guān)分析(兩變量為非正態(tài)分布數(shù)據(jù))。取雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 比較分析RA患者和對照者外周血NK細胞數(shù)量采用流式細胞術(shù)分析RA患者和對照者外周血NK(CD56+CD3-)細胞數(shù)量，結(jié)果如圖1所示，RA患者外周血NK細胞占淋巴細胞百分比為7.00(5.00，10.80)%，顯著低于對照者10.56(7.63，15.30)%，差異有統(tǒng)計學意義(U=256.5，P=0.005 1)；RA患者外周血NK細胞絕對數(shù)為71.98(48.72，176.64)×109/ml，顯著低于對照者204.94(137.88，341.54)×109/ml，差異有統(tǒng)計學意義(U=172.0，P<0.000 1)。

2.2 比較分析RA患者和對照者外周血NK細胞上TIGIT的表達水平采用流式細胞術(shù)檢測RA患者和對照者外周血NK上TIGIT的表達，結(jié)果如圖2所示，RA患者外周血NK細胞上TIGIT的表達的平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)為(5.69±2.10)，顯著低于對照者(8.89±2.80)，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.050，P<0.000 1)；而外周血NK細胞上TIGIT的表達百分率在兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(t=0.245，P>0.050 0)。

2.3 分析RA患者外周血NK細胞上TIGIT的表達與炎癥指標的關(guān)系RA患者外周血NK細胞上TIGIT的表達的MFI與CRP呈負相關(guān)(r=-0.346 3,P=0.048 4)，而與ESR不相關(guān)。

2.4 分析RA患者外周血NK細胞上TIGIT的表達與自身抗體的關(guān)系RA患者外周血NK細胞上TIGIT表達的MFI與RF呈負相關(guān)(r=-0.360 7,P=0.042 6)，而與CCP抗體不相關(guān)(r=-0.107 7，P=0.557 4)；進一步分析抗體陽性的RA患者其自身抗體的水平與TIGIT表達MFI的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RF陽性的RA患者的RF與NK細胞上TIGIT表達的MFI也呈負相關(guān)(r=-0.400 5,P=0.047 3)，而CCP抗體陽性的RA患者的CCP抗體與NK細胞上TIGIT表達的MFI不相關(guān)(r=-0.113 1,P=0.582 1)。

圖1 RA患者和對照者外周血NK細胞數(shù)量

A：對照者和RA患者NK細胞(CD56+CD3-)流式散點圖；1：對照者；2：RA患者；B：NK細胞百分率在對照者和RA患者的分布情況；C：NK細胞數(shù)量在對照者和RA患者的分布情況；與對照者比較：**P<0.01，***P<0.001

圖2 RA患者和對照者外周血NK細胞上TIGIT的表達

A：對照者和RA患者外周血NK細胞TIGIT表達的流式代表圖；1：對照者同型；2：對照者TIGIT表達；3：RA患者同型；4：RA患者TIGIT表達；B：NK細胞TIGIT表達MFI在對照者和RA患者的分布情況；C：NK細胞TIGIT表達百分率在對照者和RA患者的分布情況；與對照者比較：***P< 0.001

2.5 分析RA患者外周血NK細胞上TIGIT的表達與疾病嚴重程度的關(guān)系RA患者外周血NK細胞上TIGIT表達的MFI與DAS28不相關(guān)(r=0.124 2,P=0.490 5)，但早期組RA患者外周血NK細胞上TIGIT表達的MFI明顯低于非早期組RA患者，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3(U=43.5，P=0.038 5)。

3 討論

RA是一種常見的以關(guān)節(jié)受累為主的慢性全身性自身免疫病，除關(guān)節(jié)外，其他組織和器官比如心、肺、神經(jīng)系統(tǒng)也可受累，增加了疾病的致殘率及致死率。越來越多的證據(jù)表明NK細胞在RA的致病中起著重要作用[4-5]，本研究發(fā)現(xiàn)RA患者的外周血NK細胞數(shù)明顯低于正常對照者，與之前的研究報道是相符的[12]。這些結(jié)果表明作為免疫系統(tǒng)中重要免疫細胞——NK細胞的數(shù)量異常與機體的免疫功能異常有關(guān)，進一步說明NK細胞的異常與RA的發(fā)病存在不可忽視的作用。

圖3 RA患者外周血NK細胞上TIGIT的表達與疾病嚴重程度的關(guān)系與早期組相比：*P<0.05

RA患者中NK細胞的異常，不僅表現(xiàn)為數(shù)量的異常，還有研究報道其功能存在異常[8]。TIGIT作為一種抑制性共刺激分子，已有研究表明TIGIT表達的差異可調(diào)控NK細胞的表型和功能的異質(zhì)性，比如調(diào)節(jié)NK細胞的脫顆粒和細胞因子IFN-γ的釋放[13]。但關(guān)于RA患者NK細胞上TIGIT所執(zhí)行的具體功能還不是很明確，本研究檢測了RA患者外周血NK細胞上TIGIT的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者外周血NK細胞TIGIT的表達水平明顯低于正常對照組，且與炎癥指標和抗體的產(chǎn)生呈負相關(guān)，表明TIGIT的表達水平越低，RA患者的炎癥程度越高，以及體內(nèi)自身抗體的含量越高。進一步研究分析發(fā)現(xiàn)初診RA患者外周血NK細胞TIGIT的表達水平明顯低于復診患者，提示TIGIT的表達水平越低，疾病越嚴重。

越來越多的研究證實TIGIT作為負性共刺激分子，在自身免疫性疾病中呈現(xiàn)的是抑制功能，比如，Joller et al[14]研究表明TIGIT缺失的小鼠可出現(xiàn)T細胞增殖活化增強，進而誘發(fā)RA、SLE等自身免疫性疾??；課題組之前的研究也表明SLE患者NK細胞上TIGIT執(zhí)行抑制功能參與其致病[15]；Zhao et al[7]研究證實類風濕關(guān)節(jié)炎小鼠的CD4 T細胞所執(zhí)行的致病作用可被TIGIT抑制，從而緩解相應的臨床癥狀。此外，Wang et al[13]研究表明RA患者外周血NK細胞上TIGIT的表達降低，與本研究結(jié)果一致，但其只闡述了TIGIT的表達情況。本研究進一步分析RA患者NK細胞上TIGIT的表達與臨床的關(guān)系表明，RA患者NK細胞上TGIT呈現(xiàn)的是抑制作用。

綜上，RA患者NK細胞表面表達的TIGIT明顯降低，并且與炎癥程度、自身抗體以及RA患者的嚴重程度相關(guān)，提示TIGIT可作為疾病嚴重的指標之一。進一步探討TIGIT如何調(diào)控RA患者免疫細胞功能，將對闡述TIGIT在RA中所執(zhí)行的免疫調(diào)節(jié)機制及為RA的臨床免疫治療提供新思路。