紅細(xì)胞微粒的促凝血性質(zhì)與小鼠急性肺損傷的關(guān)系

朱躍躍，卞茂紅，謝如鋒

儲(chǔ)存紅細(xì)胞主要為臨床用血做準(zhǔn)備，因此對(duì)其病理生理作用進(jìn)行分析，有助于進(jìn)一步提高輸注療效。近年來(lái)，輸注紅細(xì)胞引起的不良反應(yīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注,有研究報(bào)道輸血相關(guān)急性肺損傷(transfusion- related acute lung injury,TRALI)已成為輸血不良反應(yīng)中導(dǎo)致死亡的首要因素[1]，有關(guān)TRALI的發(fā)生機(jī)制目前尚未完全闡述清楚。紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列生化和形態(tài)上如血紅蛋白增加、微粒產(chǎn)生等改變，稱(chēng)之為“儲(chǔ)存損傷”[2]。其中微粒是一種由不同類(lèi)型的細(xì)胞如血小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞等釋放的一種漿膜囊泡，其直徑一般是在0.1～1 μm之間[3]。紅細(xì)胞微粒(red blood cell-derived microparticles,RMPs)平均大小為0.15 μm，與其他類(lèi)型微粒類(lèi)似，其表面含有的磷脂，尤其是磷脂酰絲氨酸(PS)，被認(rèn)為是其具有促凝活性的重要介質(zhì)之一。RMPs上富含的補(bǔ)體C可通過(guò)中性粒細(xì)胞表面表達(dá)的Fc受體來(lái)活化中性粒細(xì)胞，而中性粒細(xì)胞的活化在TRALI的發(fā)病機(jī)制中起到了至關(guān)重要的作用。

系統(tǒng)性炎癥和肺部的凝血活性升高是TRALI的重要臨床表現(xiàn)之一。該研究擬通過(guò)研究紅細(xì)胞微粒的促凝血活性，并結(jié)合小鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探索其與TRALI發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 血液與動(dòng)物來(lái)源隨機(jī)抽取250 ml規(guī)格的懸浮紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)樣本(ACD 抗凝，4 ℃保存，有效期35 d)，該制品來(lái)自上海市血液中心。

6～8周齡的雄性BALB/C小鼠若干只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑與儀器熒光抗體APC-鼠抗人CD235a、AnnexinV/FITC(美國(guó) BD 公司)；羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE,美國(guó)Thermo Scientific公司)；小鼠凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物試劑盒、小鼠纖溶酶原試劑盒、小鼠纖溶酶原激活物抑制因子1(美國(guó)abcam公司)；流式細(xì)胞儀、全自動(dòng)血凝儀ACL7000(美國(guó)Beckman Coulter公司)；Fluoroskan Ascent FL 熒光讀數(shù)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；凝血酶試劑盒及軟件(荷蘭Thrombinoscope BV公司)。

1.3 RMPs的分離純化RMPs的分離方法參考Jy et al的并加以改良[4]。分別取保存1、7、14、21、28、35 d的紅細(xì)胞懸液于50 ml 規(guī)格離心管中,4 ℃,3 590 r/min,離心20 min后,取上清液1.5 ml于EP管中,4 ℃、14 770 r/min下離心60 min后,棄去上清后得到RMPs沉淀,先吸取200 μl微粒洗液于EP管中并吹打混勻,再吸取800 μl 微粒洗液,4 ℃、14 770 r/min下離心60 min后棄去上清液,加入150 μl PBS獲得濃縮10倍的RMPs懸液。

1.4 RMPs的計(jì)數(shù)取30 μl紅細(xì)胞上清液或10 μl純化RMPs懸液，加入5 μl APC-鼠抗人CD235a單克隆抗體及6 μl CFSE,用PBS加至總體積為100 μl ，室溫避光孵育20 min后，加入500 μl PBS混勻。最后吸取500 μl至計(jì)數(shù)管中。立即使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)5 000個(gè)微球。RMPs數(shù)目按照以下公式計(jì)算：(包含RMPs區(qū)域的數(shù)目×計(jì)數(shù)管微球的總數(shù)目×稀釋倍數(shù))/(設(shè)定的計(jì)數(shù)微球數(shù)×體積)。

1.5 活化部分凝血酶原時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定根據(jù)RMPs計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整RMPs懸液體積，加入100 μl RMPs懸液和300 μl相應(yīng)14 770 r/min下離心去微粒血漿，設(shè)置所含RMPs的濃度分別為0.5×103、1×103、5×103、10×103、20×103個(gè)/μl。上清液組：100 μl 紅細(xì)胞上清液加入300 μl離心后去微粒血漿；離心組：用100 μl經(jīng)14 770 r/min離心后的紅細(xì)胞上清液與300 μl相應(yīng)經(jīng)離心后的去微粒血漿混合；過(guò)濾組：用0.1 μm濾器過(guò)濾后的紅細(xì)胞上清液與300 μl相應(yīng)經(jīng)離心后的去微粒血漿混合；對(duì)照組：100 μl PBS加入300μl離心后去微粒血漿。隨后在A(yíng)CL7000 全自動(dòng)血凝儀下檢測(cè)其APTT、PT值。

1.6 凝血酶生成實(shí)驗(yàn)?zāi)干蓪?shí)驗(yàn)使用自動(dòng)校正凝血酶曲線(xiàn)法(calibrated automated thrombogram,CAT)，借助于Fluoroskan Ascent FL熒光讀數(shù)儀。校準(zhǔn)孔中加入80 μl標(biāo)準(zhǔn)血漿和20 μl凝血酶校準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)孔中加入80 μl上述APTT和PT實(shí)驗(yàn)中的各種血漿和20 μl PRP試劑，每個(gè)標(biāo)本及校準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)儀器提示清洗，填充含熒光底物及Ca2+(FluCa)后機(jī)器自動(dòng)向各孔中加入20 μl FluCa，通過(guò)Thrombinoscope軟件繪制60 min內(nèi)的凝血酶生成曲線(xiàn)。凝血酶生成曲線(xiàn)主要包含4個(gè)參數(shù)：延遲時(shí)間(lag time)、峰值(peak)、達(dá)峰時(shí)間 (time to peak，tt-peak)和凝血酶生成潛力(endogenous thrombin potential，ETP)。

1.7 小鼠肺泡灌洗液的收集所有小鼠在無(wú)病原體環(huán)境中適應(yīng)生活3 d，之后小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射300 μl RMPs懸液(數(shù)目分別為1×107、2×107、3×107個(gè))，對(duì)照組小鼠尾靜脈注射300 μl PBS，2 h后小鼠脫頸椎安樂(lè)死，仰位固定，把小鼠喉嚨處皮膚剪開(kāi)，用鑷子把氣管周?chē)M織分離開(kāi)，氣管暴露出來(lái)。靜脈留置針插入氣管上端，然后拿一根線(xiàn)，從氣管下穿過(guò)，把留置針和氣管一起結(jié)扎，再拔出針芯，然后注射器吸取一定量的PBS推進(jìn)氣管即可進(jìn)行灌洗，本實(shí)驗(yàn)灌洗3次，PBS用量分別為700、600、600 μl。將收集的全部肺泡灌洗液在4 ℃、3 500 r/min下離心15 min，之后將離心后的肺泡灌洗液置-80 ℃保存以備后用。

1.8 小鼠肺泡灌洗液的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(thrombin-antithrombin complex，TATc)、纖溶酶原(plasminogen，PLG)及纖溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液的TATc、PLG及PAI-1檢測(cè)按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.9 小鼠肺組織病理檢查上述輸注量為3×107個(gè)RMPs的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠脫頸椎安樂(lè)死后，經(jīng)氣管注射4%多聚甲醛使小鼠肺部充氣。 之后一側(cè)肺葉結(jié)扎切除后浸泡在4%多聚甲醛溶液中并在4 ℃條件下過(guò)夜固定，在酒精中連續(xù)脫水并嵌入石蠟中。5 μm厚的肺組織用于常規(guī)蘇木精-伊紅染色，在奧林巴斯顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀(guān)察。

2 結(jié)果

2.1 RMPs計(jì)數(shù)取5份血庫(kù)保存的紅細(xì)胞懸液，分別在儲(chǔ)存1、7、14、21、28及35 d取樣。RMPs在流式細(xì)胞儀中被標(biāo)記為CFSE陽(yáng)性和CD235a陽(yáng)性的細(xì)胞群。見(jiàn)圖1。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，RMPs數(shù)目一直呈上升趨勢(shì)。在第28天時(shí)RMPs數(shù)目顯著增加，到保存第35天時(shí)數(shù)目相比第1天時(shí)增加了19倍 ,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.415，P=0.000 6)。見(jiàn)圖2。

2.2 部分APTT及PT測(cè)定與對(duì)照組相比，加入過(guò)濾紅細(xì)胞上清液的去微粒血漿的APTT時(shí)間明顯延長(zhǎng)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.080,P=0.011 6),各組檢測(cè)的PT值沒(méi)有明顯變化。見(jiàn)圖3。隨著向去微粒血漿中添加RMPs數(shù)目的增加，APTT值隨之減少，在RMPs濃度達(dá)到20×103個(gè)/μl時(shí),APTT值下降較為明顯。PT值實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組無(wú)明顯變化，各濃度之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

圖1 紅細(xì)胞上清液中RMPs計(jì)數(shù)

R1：前向散射(FSC)和側(cè)角度散射(SSC)區(qū)域表示微粒數(shù)目；R2：收集5 000個(gè)計(jì)數(shù)微球；R3：CD235a和CFSE雙陽(yáng)區(qū)域表示RMPs數(shù)目

圖2 儲(chǔ)存1～35 d的紅細(xì)胞上清中RMPs的數(shù)目

圖3 加入不同處理的紅細(xì)胞上清液的去微粒血漿的APTT及PT值

2.3 凝血酶生成實(shí)驗(yàn)在延遲時(shí)間實(shí)驗(yàn)中加入紅細(xì)胞上清液的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.737,P<0.000 1)；達(dá)峰時(shí)間試驗(yàn)中加入紅細(xì)胞上清液的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組在時(shí)間上也明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.666,P<0.000 1)；與此同時(shí)ETP及峰值卻明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為(t=15.65，P<0.000 1；t=4.635,P=0.003 6)。見(jiàn)圖5。當(dāng)RMPs濃度為5×103個(gè)/μl時(shí)，四種參數(shù)的變化最為顯著，此時(shí)用表示分別是延遲時(shí)間為(3.51±0.17)min，峰值為(327.49±36.28)nmol/L，達(dá)峰時(shí)間為(5.95±0.16)min，ETP為(2 070.52±207.56) nmol/L·min。之后即使增加RMPs的濃度，各參數(shù)也沒(méi)有明顯變化，甚至ETP還有下降的趨勢(shì)。見(jiàn)圖6。

圖4 去微粒血漿中加入不同濃度RMPs的APTT及PT值

1：對(duì)照組；2：去微粒血漿中加入0.5×103個(gè)/μl的RMPs；3：去微粒血漿中加入1×103個(gè)/μl的RMPs；4：去微粒血漿中加入5×103個(gè)/μl的RMPs；5：去微粒血漿中加入10×103個(gè)/μl的RMPs；6:去微粒血漿中加入20×103個(gè)/μl的RMPs

圖5 加入不同處理的紅細(xì)胞上清液的去微粒血漿的凝血酶生成實(shí)驗(yàn)四個(gè)參數(shù)結(jié)果

1.對(duì)照組； 2.上清液組； 3.過(guò)濾組； 4.離心組;與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1

2.4 小鼠肺泡灌洗液的TATc、PLG及PAI-1檢測(cè)結(jié)果小鼠肺泡灌洗液檢測(cè)指標(biāo)中，實(shí)驗(yàn)組中TATc、PLG和PAI-1檢測(cè)值與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖7。

圖6 加入不同數(shù)目的RMPs的去微粒血漿的凝血酶生成實(shí)驗(yàn)四個(gè)參數(shù)結(jié)果

1：對(duì)照組；2：去微粒血漿中加入紅細(xì)胞上清液；3：去微粒血漿中加入0.5×103個(gè)/μl的RMPs；4：去微粒血漿中加入1×103個(gè)/μl的RMPs；5：去微粒血漿中加入5×103個(gè)/μl的RMPs；6：去微粒血漿中加入10×103個(gè)/μl的RMPs；7:去微粒血漿中加入20×103個(gè)/μl的RMPs；與對(duì)照組比較：**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

圖7 小鼠肺泡灌洗液的TATc、PLG及PAI-1檢測(cè)結(jié)果

1：對(duì)照組；2：尾靜脈注入1×107個(gè)RMPs的小鼠；3：尾靜脈注入2×107個(gè)RMPs的小鼠；4：尾靜脈注入3×107個(gè)RMPs的小鼠

2.5 小鼠肺病理組織切片結(jié)果小鼠肺組織用蘇木精-伊紅染色來(lái)進(jìn)行組織學(xué)檢查，與對(duì)照組比較，尾靜脈注射RMPs的實(shí)驗(yàn)組小鼠肺泡壁發(fā)生損傷、斷裂，細(xì)胞浸潤(rùn)增加，肺泡間隙蛋白質(zhì)、中性粒細(xì)胞等大量增加，大量纖維蛋白的沉積，導(dǎo)致血管堵塞以及微循環(huán)受損。見(jiàn)圖8。

圖8 小鼠肺組織病理HE染色 ×200

A：對(duì)照組為尾靜脈注入PBS的小鼠肺組織；B:實(shí)驗(yàn)組為尾靜脈注入3×107個(gè)RMPs的小鼠肺組織

3 討論

輸注儲(chǔ)存的紅細(xì)胞可能引起包括感染、TRALI等輸血不良反應(yīng)，尤其是TRALI已經(jīng)成為輸血不良反應(yīng)死亡的首要原因。最近的研究表明長(zhǎng)期儲(chǔ)存的紅細(xì)胞懸液中釋放的RMPs與輸血不良反應(yīng)有較高相關(guān)性[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)APTT和PT結(jié)果表明RMPs通過(guò)內(nèi)源性凝血途徑促進(jìn)凝血，與外源性凝血途徑?jīng)]有直接的關(guān)系。有的研究表明RMPs通過(guò)FⅫ啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑[7]，也有的研究證明RMPs通過(guò)FⅪ啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑[8]。而Jy et al[9]又證實(shí)了RMPs通過(guò)獨(dú)立與內(nèi)源性途徑之外的途徑促進(jìn)凝血，說(shuō)明RMPs上含有組織因子參與凝血過(guò)程，但是也有研究指出在RMPs中并沒(méi)有檢測(cè)到組織因子[8]。造成這些不一致結(jié)果的原因可能是不同的研究設(shè)計(jì)方法、微粒分離純化的方式以及各種各樣的預(yù)分析因素所致。

本實(shí)驗(yàn)可以看出來(lái)紅細(xì)胞上清液經(jīng)過(guò)濾處理后，還是具有一定的凝血酶活性，而經(jīng)過(guò)14 770 r/min高速離心處理的上清液基本沒(méi)有凝血酶活性。原因可能是使用的濾器沒(méi)有濾除體積更小的RMPs。本研究中，14 770 r/min高速離心后的紅細(xì)胞上清液中RMPs計(jì)數(shù)為(26±12)/μl,約99.8%的RMPs通過(guò)離心被去除，而在前期研究中發(fā)現(xiàn)0.1 μm濾器過(guò)濾紅細(xì)胞上清液使得約99.6%的RMPs去除[10]。當(dāng)前對(duì)RMPs的計(jì)數(shù)主要通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)進(jìn)行，但是流式細(xì)胞儀只能對(duì)直徑>200 nm的囊泡精確定量，而RMPs的平均直徑大小為150 nm。所以計(jì)數(shù)RMPs時(shí)，往往低估了直徑較小的RMPs。在RMPs濃度很高的樣本中，由于RMPs的黏附特性，流式細(xì)胞儀不能區(qū)分其到底是大的RMPs還是聚集的RMPs，從而也可能低估了RMPs的數(shù)量[4]。而事實(shí)上微粒<200 nm部分已被證明至少占了50%的凝血酶生成能力[11]。由于微粒計(jì)數(shù)方面的差異可能是導(dǎo)致關(guān)于RMPs性質(zhì)和功能的爭(zhēng)論如此之多的另一部分原因。

通過(guò)凝血酶生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，RMPs的濃度在一定范圍內(nèi)可以促進(jìn)凝血酶的生成，而超過(guò)一定濃度后不僅不會(huì)促進(jìn)凝血酶生成，反而會(huì)抑制。這可能與RMPs的抗凝血活性有關(guān)，已經(jīng)證實(shí)了RMPs可以結(jié)合蛋白C的輔因子蛋白S，進(jìn)而降低了FVa和FⅦa活性，抑制了tenase和凝血酶原酶活性，從而導(dǎo)致凝血途徑的抑制[12]。

小鼠肺葉病理結(jié)果表明輸注RMPs導(dǎo)致小鼠肺組織內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇及促凝機(jī)制增強(qiáng)。這說(shuō)明RMPs能刺激某些細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化[10,13]，且RMPs膜表面攜帶的PS可提供某些凝血因子的結(jié)合位點(diǎn)，激活凝血機(jī)制導(dǎo)致凝血酶的生成[14-15]，從而加速急性肺損傷的發(fā)生。而患者輸入保存時(shí)間超過(guò)28 d的紅細(xì)胞可能會(huì)由于大量RMPs的存在，使得肺微血管血栓形成，引起缺血性肺損傷，進(jìn)而導(dǎo)致TRALI等輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。

盡管紅細(xì)胞輸注是臨床上常用輔助治療手段之一，但輸注紅細(xì)胞同樣存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性，紅細(xì)胞制品在儲(chǔ)存過(guò)程中隨著儲(chǔ)存天數(shù)的增加，其釋放的RMPs數(shù)目顯著增加，RMPs具有的促炎及促凝活性與引發(fā)輸血患者產(chǎn)生如TRALI等不輸血良反應(yīng)有關(guān)。因此，減少紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷，并采取相應(yīng)的手段減少紅細(xì)胞制品中的RMPs數(shù)目，這將對(duì)提高臨床輸血的安全性和有效性有很大的幫助。