miR-375啟動(dòng)子甲基化在MIN6細(xì)胞中存在狀況的研究

高 敏，尹 亮，況雪梅，常向云

研究[1]顯示，miR-375基因在調(diào)節(jié)胰腺生長發(fā)育、胰島β細(xì)胞增殖和胰島素分泌中起重要作用。表觀遺傳學(xué)可能會(huì)影響正常糖耐量者(normal glucose tolerance，NGT)對2型糖尿病的易感性。越來越多的研究表明，異常的DNA甲基化模式可作為T2DM的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)標(biāo)志[3-6]。然而，沒有研究能確定已建立的胰腺β細(xì)胞系中存在miR-375啟動(dòng)子甲基化模式。且目前在糖尿病研究中，對miR-375受DNA去甲基化的調(diào)控作用少見報(bào)道。該研究用5-Aza-CdR處理MIN6細(xì)胞，以明確DNA甲基化的調(diào)節(jié)是否可以影響miR-375的表達(dá)，并通過MassARRAY平臺(tái)分析MIN6細(xì)胞的DNA甲基化譜。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠胰島β細(xì)胞株由川北醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心提供。從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫采購小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株；5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-deoxycytidine，5-Aza-CdR)購自美國Sigma公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、瓊脂糖和高糖型DMEM 培養(yǎng)基購自新疆賽默飛生物工程技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT)、青鏈霉素液購自北京索萊寶科技有限公司；QIAamp DNA Mini Kits 50(QIAGEN51304)、miRNeasy Mini Kit 50(QIAGEN 217004)及miScript II RT Kit 50(QIAGEN218161)試劑盒購自北京雅安達(dá)生物科技有限公司；EZ DNA甲基化試劑盒(The EZ DNA Methylation Kit)購自美國Zymo Research生物公司；MassARRAY質(zhì)譜儀、MassCLEAVE試劑盒及PCR試劑盒購自美國Sequenom公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與處理 NIH3T3細(xì)胞作為空白對照組；PBS組作為溶劑對照組。5-Aza-CdR處理MIN6細(xì)胞組作為實(shí)驗(yàn)組。設(shè)定6種5-Aza-CdR濃度梯度(0、0.08、0.4、2、10及50 μmol/L)處理MIN6 細(xì)胞后共分為三大組，即：24 h組、48 h組、72 h組。

1.2.2MIN6及NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng) 用高糖DMEM培養(yǎng)基，其中含有10% FBS、青霉素100 U/L及鏈霉素100 mg/L，另向MIN6細(xì)胞株培養(yǎng)基中加入β-巰基乙醇0.1 mmol/L，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3MTT檢測MIN6細(xì)胞的活力 取指數(shù)生長期 MIN6 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按1×104個(gè)/ml接種到96孔板，每孔100 μl培養(yǎng)24 h；細(xì)胞貼壁后棄上清液，每組加入100 μl含不同濃度5-Aza-CdR的培養(yǎng)基，陰性對照為空白對照；置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育；各孔加入MTT 20 μl(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清液并每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，低速震蕩10 min；酶標(biāo)儀490 nm 波長下測定各孔OD值。

1.2.4引物合成 用EpiDesigner設(shè)計(jì)PCR引物，miR-375引物序列：上游5′-AGGAAGAGAGGTTTAGAGTTTGAGGGTAGGGTAGG-3′，下游5′-CAGTA ATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTAAAAACTCA TCCACCAAACACC-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.5基因組DNA提取 根據(jù)QIAamp DNA Mini Kits 50(QIAGEN51304)試劑盒要求提取DNA，將提取的DNA樣品儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。

1.2.6亞硫酸氫鹽處理DNA 根據(jù) EZ DNA Methylation Kit的說明進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，洗脫并純化DNA。終體積為30 μl，-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7PCR擴(kuò)增 使用PCR試劑盒， PCR預(yù)混合物2 μl和引物1 μl到384孔PCR板，將經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA 1.5 μl加入到PCR板中，并以5 000 r/min離心1 min。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、4 min；然后94 ℃、20 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，總共45個(gè)循環(huán)。最后在72 ℃下3 min，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于4 ℃下儲(chǔ)存。

1.2.8蝦堿性磷酸酶(SAP)處理 取SAP混合物(SAP 0.3 μl+無核糖核酸酶1.7 μl)2 μl加入到5 μl PCR產(chǎn)物中，混勻并離心384孔板，37 ℃孵育20 min，85 ℃孵育5 min，4 ℃存儲(chǔ)；孵育后置于-20 ℃過夜儲(chǔ)存。

1.2.9體外轉(zhuǎn)錄 依據(jù)MassCLEAVE試劑盒說明書配置轉(zhuǎn)錄混合物，取其5 μl與2 μl PCR產(chǎn)物到384孔板，封膜，5 000 r/min離心1 min，37 ℃孵育3 h，4 ℃存儲(chǔ)。

1.2.10樣品純化 向微孔板各孔中加入6 mg CLEAN Resin，放置10 min；向384 孔板的各孔中加入20 μl雙蒸水；將CLEAN Resin轉(zhuǎn)移至384孔板；封膜并快速離心微孔板5 000 r/min、1 min，旋轉(zhuǎn)10 min，3 000 r/min離心5 min后備用。

1.2.11MassARRAY技術(shù)進(jìn)行定量DNA甲基化分析 利用MassARRAY Nanodispenser從384孔板裂解反應(yīng)溶液中分別取出15 μl裂解所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到基質(zhì)芯片中，并應(yīng)用MassARRAY質(zhì)譜儀(Bruker-Sequenom)收集質(zhì)譜圖，用EpiTYPER v1.0.5 軟件進(jìn)行甲基化數(shù)據(jù)分析。

1.2.12細(xì)胞RNA提取 根據(jù)miRNeasy Mini Kit 50(QIAGEN217004)試劑盒要求提取RNA，樣本置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.13總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、RT-PCR反應(yīng) 根據(jù)miScript II RT Kit 50 (QIAGEN218161)試劑盒要求將總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，運(yùn)用qRT-PCR 檢測miR-375基因表達(dá)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃、15 min；然后94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，70 ℃、30 s，總共40個(gè)循環(huán)。

1.2.14熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用ABI PRISM 7300 HT 軟件分析所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用2-ΔCt方程式：ΔCt=Ct(miR-375)-Ct(U6)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組miR-375與對照組的比值，其中U6用作內(nèi)源對照，用校正后的Ct值(2-ΔCt)來對各組間 miR-375的表達(dá)差異進(jìn)行對比。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度 5-Aza-CdR 對 MIN6 細(xì)胞增殖的影響結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著DNA甲基化抑制劑5-Aza-CdR濃度和時(shí)間的增加，對MIN6細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)其濃度為50 μmol/L時(shí)，抑制作用逐漸減弱。2 μmol/L組的 5-Aza-CdR溶液分別作用MIN6細(xì)胞24、48、72 h后與其余各濃度組比較，OD值不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且各時(shí)間點(diǎn)之間進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 miR-375在各組中甲基化聚類分析如圖2所示，相對于MIN6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中mmu-miR-375的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，甲基化研究區(qū)域位于+199 bp～+491 bp之間。經(jīng)分類分析后發(fā)現(xiàn)這些組的定量甲基化水平進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。在這些組中分析了在mmu-miR-375的特定啟動(dòng)子區(qū)域上覆蓋18個(gè)CpG單元(293 bp，包含總共29個(gè)CpG位點(diǎn)，在所有分析的樣品中總共551個(gè)CpG位點(diǎn))。而在NIH3T3細(xì)胞中，未檢測出miR-375異常DNA甲基化。

圖1 5-Aza-CdR 對MIN6 細(xì)胞增殖的影響

5-Aza-CdR與MIN6細(xì)胞增殖的關(guān)系：與24 h組相比：*P<0.05；與48 h組相比：△P<0.05

2.3 miR-375甲基化質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析用不同濃度5-Aza-CdR分別處理MIN6細(xì)胞24、48、72 h后，檢測到miR-375基因DNA在每組細(xì)胞中均高度甲基化(圖3)，其中50 μmol/L組miR-375平均甲基化率最低。

2.4 mmu-miR-375表達(dá)水平與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性分析分析mmu-miR-375啟動(dòng)子的CpG甲基化程度與miR-375的相對表達(dá)水平之間的相關(guān)性后，發(fā)現(xiàn)在MIN6細(xì)胞中，DNA甲基化水平與miR-375的相對表達(dá)水平之間負(fù)相關(guān)(r=-0.71，F(xiàn)=4.114，P=0.01)。見表1。

2.5 MIN6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞間的mmu-miR-375表達(dá)水平比較通過qRT-PCR檢測MIN6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中mmu-miR-375的相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，經(jīng)5-Aza-CdR處理的MIN6細(xì)胞中mmu-miR-375的相對表達(dá)低于未經(jīng)處理的NIH3T3細(xì)胞(P<0.05，圖4)。

3 討論

近年來，有關(guān)表觀遺傳學(xué)機(jī)制在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用的研究越來越多[2]。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)水平受甲基化修飾的影響，使之成為表觀遺傳學(xué)修飾的重要機(jī)制之一。目前部分研究是在全基因組DNA的甲基化修飾水平上檢測掃描與糖尿病相關(guān)基因的差異脫氧核糖核酸甲基化，比如Hall et al發(fā)現(xiàn)人胰島中標(biāo)注為PDX1的CpG位點(diǎn)在暴露于高糖環(huán)境48 h后，其DNA甲基化增加[3]。還有研究是針對糖尿病功能已知的相關(guān)基因，使用特定的引物檢測差異脫氧核糖核酸甲基化，比如Dayeh et al研究表明40個(gè)2型糖尿病相關(guān)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)中的19個(gè)(48%)引入或移除了CpG位點(diǎn)[4]。故從表觀遺傳學(xué)角度來探討并揭示T2DM的發(fā)病機(jī)制及篩選個(gè)體化治療分子靶點(diǎn)具有重要意義。

圖2 miR-375在各組中甲基化聚類分析結(jié)果

箭頭：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site，TSS)；垂直條：雙核苷酸(CpG)位點(diǎn)；灰色填充框：CGI；黑色填充條：MassARRAY檢測區(qū)域，黑色條下方顯示了擴(kuò)增子特征；bp表示堿基對；每行代表用5-Aza-CdR處理24、48和72 h樣品；每列代表CpG單元，其是單個(gè)CpG位點(diǎn)或CpG位點(diǎn)的組合；不同的顏色編碼反映不同的甲基化程度，黃色為100%，紅色為0%

表1 mmu-miR-375基因的表達(dá)水平與其啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化之間的相關(guān)性

圖3 各組中平均甲基化率的比較

圖4 mmu-miR-375在MIN6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的比較

胰腺發(fā)育、胰島素分泌以及胰腺細(xì)胞的生長和增殖受miR-375基因調(diào)控。胰腺中miR-375基因表達(dá)的減少在糖尿病的發(fā)病機(jī)制起重要作用[1]。課題組前期研究表明T2DM患者外周血白細(xì)胞中miR-375啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平低于NGT人群，且其甲基化程度與血漿中miR-375基因的表達(dá)水平具有負(fù)相關(guān)性[5]。也有研究顯示，miR-375基因的表達(dá)可能受DNA低甲基化水平的調(diào)控，且這種DNA低甲基化水平與T2DM的發(fā)病機(jī)制有直接或間接的關(guān)系[6]。5-Aza-CdR作為常用的去甲基化藥物之一，其作用原理是在細(xì)胞周期的DNA合成期，通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來終止甲基化反應(yīng)，使得基因DNA呈去甲基化狀態(tài)，從而使抑癌基因再次得到表達(dá)。

近年來，對miRNA的甲基化逐漸深入研究后發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與其密不可分。Dong et al[7]研究顯示腫瘤抑制基因高甲基化狀態(tài)參與癌癥發(fā)生發(fā)展。目前，除了從臨床工作中獲取一定的組織標(biāo)本之外，ANC-1、CFPAC-1、PANC-1、MiaPACA-2、BXPC-3、ASPC-1、MIA、T3M4、SU86等人胰腺癌細(xì)胞株也常常被用于人胰腺腫瘤的研究中。研究表明5-Aza-CdR抑制胰腺癌 PANC-1細(xì)胞系的生長和凋亡，其抑制結(jié)果主要是通過降低癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[8]。有研究[9]表明，經(jīng)不同濃度的5-Aza-CdR處理后的胰腺癌MiaPACA-2細(xì)胞，與之相關(guān)的抑癌基因RUNX3的異常甲基化狀態(tài)可恢復(fù)正常。本研究結(jié)果顯示5-Aza-CdR在一定濃度范圍內(nèi)能抑制MIN6細(xì)胞系的生長和增殖，隨著5-Aza-CdR濃度和時(shí)間的增加，MIN6細(xì)胞系受其抑制的作用逐漸增強(qiáng)，與以前關(guān)于5-Aza-CdR藥理作用研究結(jié)果是一致的[8]。用不同濃度的5-Aza-CdR溶液處理MIN6細(xì)胞24、48、72 h后，50 μmol/L濃度組平均甲基化率低于其他濃度組。本研究中未發(fā)現(xiàn)NIH3T3細(xì)胞存在miR-375甲基化，這可能與miR-375甲基化水平具有細(xì)胞特異性，再有受限于甲基化檢測區(qū)域有關(guān)，后續(xù)可通過DNA甲基化高通量測序評估甲基化水平。

資料[10-11]顯示，人胰腺癌旁正常組織的miR-375表達(dá)水平高于胰腺癌組織，且胰腺癌細(xì)胞中miR-375基因的上調(diào)可使癌細(xì)胞凋亡加速，同時(shí)使其周期發(fā)展受阻，而miR-375的下調(diào)具有相反的作用 。但目前，尚未見有關(guān)miR-375在胰島β 細(xì)胞中甲基化程度及其表達(dá)水平的相關(guān)報(bào)道。

miR-375基因在調(diào)節(jié)胰島發(fā)育，胰島素分泌和β細(xì)胞分化中起相應(yīng)作用。Latreille et al[12]曾對此進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)敲除miR-375基因后的小鼠與未敲除時(shí)相比，其胰島α和β細(xì)胞的生長和增殖都受到一定影響，此外，miR-375基因在α和β細(xì)胞中起著完全相反的作用，血漿中只有一小部分miR-375基因源自胰島β細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-375基因甲基化水平低于對照組，呈低甲基化狀態(tài)，miR-375基因的表達(dá)水平確是對照組的171%[13]。因此，推斷miR-375基因在正常人胰島β細(xì)胞中呈高甲基化，MIN6細(xì)胞不僅能分泌胰島素，而且有葡萄糖依賴性，因此為進(jìn)行其相關(guān)功能的研究通常用MIN6細(xì)胞代替正常人胰島β細(xì)胞。但miR-375基因在MIN6 細(xì)胞中呈高甲基化狀態(tài)，而表達(dá)水平較低，推測NGT人群胰島β 細(xì)胞中miR-375 基因可能也呈高甲基化狀態(tài)，而其表達(dá)呈現(xiàn)低水平，但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。