PI3K/Akt信號(hào)通路參與LPS誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)RACK1及rac1

尤青海，王巾枚，孫耕耘，蔣麗娟，李文妹

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVEC)損傷致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)病理學(xué)特征，多種信號(hào)通路參與調(diào)控[1]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B, Akt)信號(hào)通路通過調(diào)控炎癥細(xì)胞活化和炎癥介質(zhì)釋放參與脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)介導(dǎo)的細(xì)胞損傷過程，但機(jī)制尚不明確[2]；活化的蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase 1, RACK1)是細(xì)胞支架蛋白，與多種蛋白結(jié)合，整合來自不同信號(hào)途徑的信息[3]；ras 相關(guān)C3 肉毒菌毒物底物1 (ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, rac1)作為小G蛋白成員參與內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能調(diào)控[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)Akt調(diào)控rac1活化，而RACK1與rac1活化關(guān)系密切，因此，推測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路可能通過調(diào)控RACK1/rac1參與LPS致PMVEC損傷。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)，Hyclone公司)，胎牛血清(澳大利亞，Gibco公司)，p-Akt單克隆抗體、RACK1單克隆抗體及rac1單克隆抗體(英國(guó)，Abcom公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京，中杉金橋)，LY294002(PI3K/Akt信號(hào)通路特異抑制劑，美國(guó)，Selleck公司)，IGF-1(PI3K/Akt信號(hào)通路特異激動(dòng)劑，美國(guó)，CST公司)，其余實(shí)驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，SD大鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SPF級(jí)，合格證號(hào)：SCXK(皖)2011-002]。

1.2 方法

1.2.1大鼠PMVEC分離培養(yǎng)及鑒定 按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法及參考文獻(xiàn)進(jìn)行[6]。

1.2.2Western blot檢測(cè)RACK1、rac1及p-Akt蛋白表達(dá) 裂解3代大鼠PMVEC 30 min后收集蛋白。選擇10%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液中室溫封閉2 h后，TBS-T溶液洗膜，與RACK1、rac1或p-Akt單克隆抗體(1 ∶1 000)4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG溶液(1 ∶20 000)室溫90 min孵育，底物化學(xué)發(fā)光法顯影，掃描儀掃描存盤，Quantity One軟件分析、測(cè)定各組目的蛋白與同一樣本中的內(nèi)參β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)積分光密度，比值衡量蛋白表達(dá)量的相對(duì)變化。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組和處理 (1)量效實(shí)驗(yàn)：分別以0、1、5、10 mg/L LPS與PMVEC孵育12 h；(2)時(shí)效實(shí)驗(yàn)：以10 mg/L LPS或100 ng/ml IGF-1分別與PMVEC孵育0、3、6、8、12、24 h；(3)LPS+LY294002干預(yù)組：以100 ng/ml LY294002孵育1 h后繼續(xù)加入10 mg/L LPS預(yù)孵育12 h，設(shè)空白組、LPS組和LY294002組為對(duì)照。干預(yù)結(jié)束后均檢測(cè)RACK1、rac1及p-Akt蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LPS誘導(dǎo)大鼠PMVEC表達(dá)RACK1、rac1及p-AktPMVEC低表達(dá)RACK1和rac1，0、1、5、10 mg/L LPS刺激上調(diào)rac1表達(dá)(F=165.813，P<0.001)；0、1、5、10 mg/L LPS刺激后，RACK1表達(dá)上調(diào)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=120.455，P<0.001)。LPS未刺激時(shí)，PMVEC低表達(dá)p-Akt，0、1、5、10 mg/L LPS誘導(dǎo)p-Akt表達(dá)增加，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=309.346，P<0.001)。見圖1、表1。

2.2 LPS刺激不同時(shí)間誘導(dǎo)大鼠PMVEC表達(dá)rac1、RACK1及p-Akt10 mg/L LPS刺激3 h后rac1表達(dá)增加，24 h達(dá)最高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=423.630，P<0.001)；10 mg/L LPS刺激3 h后，RACK1表達(dá)上調(diào)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=454.034，P<0.001)；10 mg/L LPS刺激3 h后，p-Akt表達(dá)上調(diào)，12 h達(dá)最高，24 h開始降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=137.726，P<0.001)。見圖2、表2。

圖1 不同濃度LPS誘導(dǎo)PMVEC表達(dá)RACK1、rac1及p-Akt

表1 不同濃度LPS與PMVEC孵育后rac1、RACK1及p-Akt的相對(duì)表達(dá)量

與0 mg/L組比較：aP<0.05；與1 mg/L組比較：bP<0.05；與5 mg/L組比較：cP<0.05

圖2 LPS刺激不同時(shí)間誘導(dǎo)PMVEC表達(dá)RACK1、rac1及p-Akt

表2 LPS與PMVEC孵育不同時(shí)間后rac1、RACK1及p-Akt的相對(duì)表達(dá)量

與0 h組比較：aP<0.05；與3 h組比較：bP<0.05；與6 h組比較：cP<0.05；與8 h組比較：dP<0.05；與12 h組比較：eP<0.05

2.3 IGF-1刺激不同時(shí)間誘導(dǎo)大鼠PMVEC表達(dá)rac1、RACK1及p-Akt100 ng/ml IGF-1刺激3 h后rac1表達(dá)上調(diào)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=115.071，P<0.001)；100 ng/ml IGF-1刺激3 h后RACK1表達(dá)上調(diào)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=188.293，P<0.001)；100 ng/ml IGF-1刺激后，p-Akt表達(dá)自3 h開始上調(diào)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.175，P<0.001)。見圖3、表3。

圖3 IGF-1刺激不同時(shí)間誘導(dǎo)PMVEC表達(dá)RACK1、rac1及p-Akt

表3 IGF-1與PMVEC孵育不同時(shí)間后rac1、RACK1及p-Akt的相對(duì)表達(dá)量

與0 h組比較：aP<0.05；與3 h組比較：bP<0.05；與6 h組比較：cP<0.05；與8 h組比較：dP<0.05；與12 h組比較：eP<0.05

2.4 LY294002對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠PMVEC表達(dá)RACK1、rac1及p-Akt的影響與LPS組比較，LPS+LY294002組PMVEC表達(dá)RACK1、rac1及p-Akt均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；LY294002單獨(dú)刺激PMVEC后，RACK1、rac1和p-Akt表達(dá)較空白組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖4、表4。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)激活的PI3K磷酸化Akt，p-Akt移動(dòng)到胞質(zhì)及胞核，再結(jié)合NF-κB、Bcl-2和mTOR等，調(diào)控炎癥細(xì)胞活化和炎癥介質(zhì)釋放，故p-Akt可作為PI3K/Akt信號(hào)通路活化的標(biāo)志物[2, 7-8]；另外，研究證實(shí)p-Akt作為L(zhǎng)PS下游信號(hào)通路，上調(diào)IL-1、IL-6和TNF-α等參與LPS損傷過程[2, 8]。本研究顯示在LPS刺激PMVEC過程中，p-Akt表達(dá)水平呈時(shí)間及濃度依賴性增加，因此，PI3K/Akt信號(hào)通路參與LPS致PMVEC損傷過程，但其下游信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚不明確。

圖4 LY294002對(duì)LPS誘導(dǎo)PMVEC表達(dá)RACK1、rac1及p-Akt干預(yù)作用

表4 LY294002影響LPS誘導(dǎo)PMVEC的rac1、RACK1及p-Akt相對(duì)表達(dá)量

與空白組比較：aP<0.05；與LPS組比較：bP<0.05；與LY294002組比較：cP<0.05

具有7個(gè)WD40位點(diǎn)的RACK1是G蛋白β亞基的同族體，可結(jié)合蛋白激酶C、Src等[9]，維持細(xì)胞活化狀態(tài)，引導(dǎo)活化蛋白前往特定區(qū)域，介導(dǎo)多種信號(hào)通路，參與炎癥反應(yīng)[3, 9-10]。研究證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路激活與RACK1密切相關(guān)：在食管鱗狀細(xì)胞癌株中過表達(dá)RACK1增加p-Akt，激活PI3K/Akt信號(hào)通路[3]。本研究表明在LPS損傷PMVEC過程中，RACK1表達(dá)水平與p-Akt一致，呈時(shí)間和濃度依賴性增加，提示PI3K/Akt信號(hào)通路與RACK1相互促進(jìn)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt特異性激動(dòng)劑誘導(dǎo)PMVEC的RACK1表達(dá)量呈時(shí)間依賴性增加，而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，RACK1表達(dá)量呈時(shí)間依賴性下降，推測(cè)RACK1可能為PI3K/Akt信號(hào)通路效應(yīng)因子。

rac1是小G蛋白家族成員，調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、黏附、骨架及內(nèi)皮細(xì)胞遷移等[5, 11-12]；rac1參與RACK1活性調(diào)控[5]，如在上皮細(xì)胞中，rac1解除Src與RACK1的綁定，進(jìn)而與RACK1形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞生長(zhǎng)[13-14]；此外，rac1也作為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)[11-12]。本研究表明在LPS誘導(dǎo)PMVEC過程中，rac1表達(dá)水平與RACK1一致，提示rac1和RACK1同步參與LPS致PMVEC損傷。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)應(yīng)用信號(hào)通路特異性激動(dòng)劑激活PI3K/Akt后，rac1表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性增加，而應(yīng)用信號(hào)通路特異性抑制劑抑制PI3K/Akt后，rac1表達(dá)水平下降，且其趨勢(shì)與RACK1一致，故推測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路可能通過調(diào)控RACK1-rac1復(fù)合物參與LPS致PMVEC損傷過程。

綜上所述，本研究證實(shí)LPS損傷PMVEC過程中，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活；LPS誘導(dǎo)大鼠PMVEC表達(dá)RACK1及rac1增加；PI3K/Akt信號(hào)通路通過調(diào)控RACK1及rac1表達(dá)參與LPS損傷PMVEC，從而為ARDS的發(fā)病和診治提供思路，但在PMVEC中，RACK1與rac1是否通過復(fù)合物形式參與PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控有待進(jìn)一步探討。