高糖刺激的巨噬細(xì)胞源外泌體對(duì)小鼠腎組織中TGF-β1/Smad3通路的影響作用

黃小抗，朱啟金，吳永貴

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥，并已成為終末期腎病重要的病因之一[1]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，最主要的機(jī)制是機(jī)體內(nèi)的高血糖微環(huán)境導(dǎo)致腎小球的濾過功能受損，引起腎小球基底膜的增厚、系膜細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積。近年越來越多的研究[2-4]證明了炎癥與DN的相關(guān)性，而巨噬細(xì)胞在其中起著至關(guān)重要的作用。除此之外，巨噬細(xì)胞是否具有其他的功能可以影響DN的發(fā)展已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[5]。外泌體是一種新的細(xì)胞與細(xì)胞間交流的方式，其內(nèi)包裹了蛋白、mRNA和microRNA(miRNA)等多種信息物質(zhì)，可以通過細(xì)胞釋放和細(xì)胞攝入的方式完成信息傳遞[6]。已經(jīng)有研究[7]發(fā)現(xiàn)DN患者體液中的外泌體對(duì)于疾病的診斷和治療都有著重要的作用。該研究前期在高糖共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞的微環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞活化和增殖能力增加，這提示巨噬細(xì)胞可能通過某種方式影響了系膜細(xì)胞。另有文獻(xiàn)[8]表明，高糖環(huán)境下的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體可以通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路促進(jìn)系膜細(xì)胞的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)，從而促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度表達(dá)。在此基礎(chǔ)下，現(xiàn)通過將外泌體注入小鼠體內(nèi)的方法，來探究不同糖刺激條件下巨噬細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)小鼠腎組織中TGF-β1/Smad3通路的影響，進(jìn)一步闡明巨噬細(xì)胞對(duì)系膜細(xì)胞功能的影響作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)購自中科院上海細(xì)胞庫。動(dòng)物購自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究所。選取體質(zhì)量20～30 g，6～8周齡的雄性SPF級(jí)C57小鼠60只。小鼠飲水、飼料和墊料均通過高壓滅菌后使用。本研究已通過安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑與耗材外泌體提取試劑盒、CD63單克隆抗體(美國SBI公司)；DMEM培養(yǎng)基(以色列Biological industries公司)；免疫組化試劑盒(PV-9000)(北京中杉金橋公司)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白(Calnexin)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、Smad3、p-Smad3單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；尿白蛋白ELISA試劑盒、CD68、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原蛋白(collagen-Ⅳ，Col-Ⅳ)、TSG101、α-SMA、單克隆抗體(英國Abcam公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞分組與培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系分為NG組(培養(yǎng)基內(nèi)含5.5 mmol/L葡萄糖)，MC組(培養(yǎng)基內(nèi)含25 mmol/L甘露醇)和HG組(培養(yǎng)基內(nèi)含25 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)。培養(yǎng)于加入10%胎牛血清與0.1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5% CO2。

1.3.2外泌體提取與鑒定 外泌體提取：細(xì)胞上清液以3 000 r/min離心15 min去除沉淀的細(xì)胞碎片，吸出上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管，按Exo Quick ∶上清液=1 ∶5加入試劑混勻，4 ℃冰箱靜置保存12 h后以1 500 r/min離心30 min去除上清液，沉淀即為外泌體。最后使用200 μl無菌磷酸緩沖液(PBS)重懸外泌體后于-80 ℃保存。外泌體鑒定：取出外泌體置于冰上解凍，加液槍輕輕吹勻后滴加10 μl在銅網(wǎng)正面，濾紙吸干邊緣多余液體，室溫晾干后滴加30 μl醋酸雙氧鈾染色3 min，隨后PBS洗滌3次，室溫晾干后將樣品置于電子顯微鏡(H-7700，日本Hitachi公司)下進(jìn)行觀察。

1.3.3外泌體蛋白提取 外泌體取出后冰上解凍，加入等體積的蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF=9 ∶1)，加液槍輕輕吹勻后迅速置于冰上裂解15 min，以12 000 r/min離心15 min去除沉淀，上清液即為外泌體蛋白。

1.3.4動(dòng)物分組與處理 為保持實(shí)驗(yàn)條件一致性，依照C57BL/6小鼠大小、體質(zhì)量、周齡等因素，最終選取一般條件相仿的30只小鼠分為三組，每組為10只。提取不同培養(yǎng)條件下的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的外泌體注射到小鼠體內(nèi)，并按照外泌體分組將動(dòng)物分為NG-Exo組(正常糖刺激外泌體注射組)，MC-Exo組(甘露醇刺激外泌體注射組)，HG-Exo組(高糖刺激外泌體注射組)；處理方法為隔天1次尾靜脈注射，持續(xù)8周。

1.3.5標(biāo)本收集 取材前1 d將小鼠放入代謝籠，收集24 h尿標(biāo)本后快速以4 000 r/min離心30 min棄去尿液沉渣，重新分裝后保存于-80 ℃冰箱。使用水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，使用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水經(jīng)腹主動(dòng)脈插管進(jìn)行灌流，觀察到腎臟增大后剪斷腎靜脈，用紗布輕輕按摩腎臟以促進(jìn)灌注完全，待腎臟顏色變白后快速取材處理。左側(cè)腎臟置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h后脫水包埋制成蠟塊，并制成3 μm的石蠟切片留作后續(xù)病理及免疫組化染色。右側(cè)腎臟于冰上迅速分割成小塊后放置凍存管內(nèi)，并凍存于液氮中用作后續(xù)Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白。

1.3.6尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER)檢測(cè) ELISA法檢測(cè)小鼠尿白蛋白含量,UAER值為尿白蛋白含量測(cè)定值與24 h尿量乘積。

1.3.7病理染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后行HE染色和PAS染色并在光鏡下觀察。在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機(jī)拍攝10個(gè)腎小球，依據(jù)系膜擴(kuò)張與腎小球總體面積比例進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分(0%)、1分(>0%～≤25%)、2分(>25%～≤50%)、3分(>50%～≤75%)、4分(>75%)。

1.3.8免疫組化 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，沖洗后依次滴加3%的甲醇過氧化氫消除組織內(nèi)源性過氧化物酶(甲醇 ∶過氧化氫=9 ∶1)，室溫孵育30 min后沖洗，高壓法修復(fù)抗原(修復(fù)液為0.1%檸檬酸鹽緩沖液)，冷卻至室溫后滴加10%山羊血清37 ℃溫箱中孵育30 min(甩去血清即可，無需沖洗)，滴加一抗孵育CD68(1 ∶200)、Col-Ⅳ(1 ∶100)、FN(1 ∶100)，于37 ℃溫箱中1 h，沖洗后滴加二抗孵育(辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG)，于37 ℃溫箱中30 min，沖洗后進(jìn)行DAB顯色。在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)腎小球，通過ImageJ軟件分析腎小球陽性細(xì)胞數(shù)及陽性百分比，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3.9Western blot 取出適量腎組織置于冰上，迅速使用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行沖洗，隨后加入適量裂解液超聲勻漿裂解，4 ℃離心30 min后去除沉淀保存上清液。留取少許上清液，通過BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并計(jì)算蛋白上樣量。取適量蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過麗春紅染色觀察條帶分布，將膜洗凈后用5%脫脂奶粉(TBST配置)室溫封閉2 h，洗膜后放入一抗孵育CD63(1 ∶1 000)、TSG101(1 ∶1 000)、Calnexin(1 ∶1 000)、FN(1 ∶5 000)、Col-Ⅳ(1 ∶5 000)、α-SMA(1 ∶20 000)、TGF-β1(1 ∶1 000)、Smad3(1 ∶5 000)、p-Smad3(1 ∶5 000)、β-actin(1 ∶3 500)，4 ℃孵育12 h，洗膜后放入HRP標(biāo)記的二抗孵育(1 ∶2 000)，室溫下孵育1 h，洗膜后用濾紙吸干多余水分，滴加ECL發(fā)光試劑，通過化學(xué)發(fā)光凝膠呈像系統(tǒng)顯影。

2 結(jié)果

2.1 外泌體電鏡及蛋白鑒定外泌體形態(tài)：圖1A可以觀察到透射電鏡下，外泌體表現(xiàn)為直徑分布在50 ～150 nm的圓形雙層膜狀結(jié)構(gòu)。圖1B說明各組蛋白均可以表達(dá)外泌體標(biāo)志物CD63與TSG101，并且不含有Calnexin，提示各組細(xì)胞上清液中提取出的外泌體中均不含有細(xì)胞成分。圖1C表明標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞數(shù)下，通過BCA定量法可以檢測(cè)外泌體相對(duì)總蛋白含量。并且結(jié)果顯示，與NG-Exo組和MC-Exo組相比，HG-Exo組中總外泌體蛋白含量增加(F=652.843,P<0.05)。

圖1 外泌體電鏡鑒定、外泌體蛋白分析及標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞數(shù)的BCA外泌體蛋白定量

A：外泌體電鏡鑒定×20 000；B：外泌體蛋白分析；C：外泌體BCA定量；a：NG-Exo組；b：MC-Exo組；c：HG-Exo組；與NG-Exo組和MC-Exo組比較：*P<0.05

2.2 各組小鼠UAER比較HG-Exo組小鼠UAER高于NG-Exo組和MC-Exo組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=91.581,P<0.05)。見圖2。

2.3 各組小鼠腎組織病理與免疫組化染色HE染色和PAS染色結(jié)果顯示，HG-Exo組中腎小球體積大于NG-Exo組與MC-Exo組，并且系膜擴(kuò)張和增殖及系膜增生指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=233.538,P<0.05)；免疫組化結(jié)果顯示HG-Exo組中巨噬細(xì)胞CD68浸潤(rùn)多于NG-Exo組與MC-Exo組(F=294.709,P<0.05)；同時(shí)HG-Exo組中Col-IV與FN表達(dá)同樣升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCol-IV=466.773，F(xiàn)FN=186.358，P<0.05)。見圖3、表1。

圖2 各組小鼠UAER比較

a：NG-Exo組；b：MC-Exo組；c：HG-Exo組;與NG-Exo組和MC-Exo組比較：*P<0.05

圖3 各組小鼠腎組織HE、PAS染色及腎組織CD68、Col-Ⅳ、FN免疫組化染色 ×400a：NG-Exo組；b：MC-Exo組；c：HG-Exo組

2.4 各組小鼠腎組織TNF-α、pro-IL-1β、IL-1β、α-SMA、Col-IV、FN蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與NG-Exo組和MC-Exo組相比，HG-Exo組小鼠腎組織中炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、pro-IL-1β與細(xì)胞外基質(zhì)α-SMA、Col-IV、FN表達(dá)升高，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FTNF-α=28.114，F(xiàn)IL-1β=37.124，F(xiàn)pro-IL-1β=7.383，F(xiàn)α-SMA=43.996，F(xiàn)Col-IV=41.624，F(xiàn)FN=54.844，均P<0.05)。見圖4。

表1 各組小鼠系膜擴(kuò)張指數(shù)及腎組織內(nèi)CD68、Col-Ⅳ和FN免疫組化

與NG-Exo組和MC-Exo組比較：*P<0.05

圖4 各組小鼠腎組織α-SMA、Col-IV、FN、TNF-α、pro-IL-1β、IL-1β蛋白變化

2.5 各組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)結(jié)果顯示HG-Exo組小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3和p-Smad3的表達(dá)高于NG-Exo組和MC-Exo組，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FTGF-β1=124.536，F(xiàn)Smad3=61.012，F(xiàn)p-Smad3=144.991，均P<0.05)。見圖5。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β對(duì)細(xì)胞免疫功能及在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程都具有重要的調(diào)節(jié)作用[9]。在TGF-β超家族的38個(gè)家族成員中，TGF-β在慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展中最為重要[10]。TGF-β具有多種亞型，其中TGF-β1與炎癥的聯(lián)系緊密。TGF-β1與受體結(jié)合后，磷酸化下游效應(yīng)因子Smad2/3，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)活性，而TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活與腎小球系膜細(xì)胞的活化有著密切的聯(lián)系[11]。

有文獻(xiàn)[12]表明，糖尿病機(jī)體在高血糖的微環(huán)境中，腎小球系膜細(xì)胞可以被誘導(dǎo)發(fā)生活化，產(chǎn)生過量的α-SMA，進(jìn)而產(chǎn)生過量的細(xì)胞外基質(zhì)。更有研究[13]表明，高糖環(huán)境下共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞存在相互作用，巨噬細(xì)胞通過這種作用促進(jìn)系膜細(xì)胞分泌炎性因子和細(xì)胞外基質(zhì)。

圖5 各組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白水平變化

a：NG-Exo組；b：MC-Exo組；c：HG-Exo組；與NG-Exo組和MC-Exo組比較：*P<0.05

近年來研究[7]發(fā)現(xiàn)外泌體與DN之間有著緊的聯(lián)系。有文獻(xiàn)[14]提出，高糖刺激下的系膜細(xì)胞可以釋放出更多的外泌體。還有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以改善糖尿病腎臟功能，其機(jī)制可能是通過分泌外泌體來抑制炎性因子TNF-α表達(dá)，從而減少系膜基質(zhì)的產(chǎn)生并同時(shí)改善小管間質(zhì)的纖維化[15]。因此，巨噬細(xì)胞釋放的外泌體在DN腎組織中的作用將是另一個(gè)重要的研究方向。本研究結(jié)果顯示HG-Exo組外泌體蛋白含量更高，這意味著高糖環(huán)境下的巨噬細(xì)胞可以釋放更多的外泌體，可能攜帶更多的信息介質(zhì)。為了進(jìn)一步觀察外泌體在小鼠腎組織內(nèi)的影響，本研究通過尾靜脈注射的方式將外泌體注入小鼠體內(nèi)，檢測(cè)小鼠腎組織病理學(xué)改變以及相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)變化，結(jié)果顯示HG-Exo組小鼠UAER增加，并且可以觀察到系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生以及腎組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增加，這提示高糖刺激的巨噬細(xì)胞源外泌體可以引起小鼠腎組織的病理學(xué)改變。通過進(jìn)一步研究顯示HG-Exo組小鼠腎組織內(nèi)TNF-α、pro-IL-1β、IL-1β、α-SMA、Col-IV、FN、TGF-β1、Smad3和p-Smad3均表達(dá)增加，提示高糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可以引起小鼠腎組織內(nèi)炎癥增加、系膜細(xì)胞的活化以及細(xì)胞外基質(zhì)的增加，其發(fā)生與TGF-β1/Smad3通路的激活有著極其密切的聯(lián)系。

綜上所述，本研究結(jié)果闡述了高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞釋放的外泌體在小鼠腎臟中的作用。在DN的發(fā)生發(fā)展中，巨噬細(xì)胞除了釋放損傷介質(zhì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)外，還可以通過釋放更多外泌體來激活TGF-β1/Smad3通路從而介導(dǎo)系膜細(xì)胞的活化，導(dǎo)致系膜細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的累積，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義，可以為DN的治療提供新的思路。但本研究中外泌體作用TGF-β1/Smad3通路的具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。