SSR 技術(shù)在果樹上的應(yīng)用

羅 球 張慶祥

（江西省撫州市臨川區(qū)茅排鄉(xiāng)政府，江西撫州 344100）

簡單重復(fù)序列（SSR）是由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，這些序列具有保守性，在生物基因組中大量存在。大量實(shí)踐結(jié)果表明，SSR 更容易被檢測出來，在果樹研究方面得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。

1 SSR 技術(shù)的概述

1.1 技術(shù)原理 對(duì)于SSR 兩端的序列來說，普遍為保守程度較高的單拷貝序列，基于此能夠完成一對(duì)特異引物的構(gòu)建，以此完成SSR-PCR，并實(shí)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列的擴(kuò)增。在電泳的支持下檢測擴(kuò)增段的多態(tài)性現(xiàn)象，即實(shí)現(xiàn)SSR 標(biāo)記。在當(dāng)前的分析中，一般使用串聯(lián)重復(fù)數(shù)的差異性完成相應(yīng)的遺傳分析，并實(shí)現(xiàn)對(duì)微衛(wèi)星DNA 長度多態(tài)性的顯現(xiàn)。

1.2 技術(shù)特點(diǎn) 對(duì)于SSR 技術(shù)來說，其在實(shí)際的應(yīng)用中主要表現(xiàn)出以下特點(diǎn)。①SSR 的數(shù)量很多，普遍可以覆蓋整個(gè)染色體組。②具有明顯的多等位基因特性，因此富含的信息量更多。③在使用中遵循孟德爾遺傳定律，呈現(xiàn)出共顯性的特征。④在實(shí)際的使用中對(duì)DNA 數(shù)量以及純度的要求較低，更容易實(shí)現(xiàn)PCR 分析，且分析結(jié)果具備更優(yōu)的重復(fù)性。⑤引物序列的順序完成，為實(shí)現(xiàn)交換提供更好的支持。

1.3 技術(shù)優(yōu)勢

1.3.1 SSR 技術(shù)與RFLP 標(biāo)記技術(shù) RFLP 標(biāo)記技術(shù)是發(fā)展最早的DNA 標(biāo)記技術(shù)，在使用中需要利用限制性內(nèi)切酶酶切DNA，并使用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA 片段。相較于RFLP 技術(shù)來說，SSR 技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的操作流程更為簡單，且分析速度更快、多態(tài)性更強(qiáng)，同時(shí)可以完成基因組串聯(lián)重復(fù)序列的檢測，這是RFLP 技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的，因此SSR 技術(shù)有著更高的應(yīng)用價(jià)值。

1.3.2 SSR 技術(shù)與RAPD 技術(shù) RAPD 技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種分析技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析。相較于RAPD 技術(shù)來說，SSR 技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中具有更強(qiáng)的重復(fù)性與穩(wěn)定性，在分析結(jié)果的比較中發(fā)揮出了更好的作用。

總體而言，SSR 技術(shù)包含RFLP 技術(shù)以及RAPD 技術(shù)的優(yōu)勢，且可在較短時(shí)間內(nèi)完成大規(guī)模的樣本分析，實(shí)用性更強(qiáng)，能夠彌補(bǔ)后兩種技術(shù)的不足，因此有著更廣闊的應(yīng)用前景。

2 SSR 技術(shù)的應(yīng)用步驟分析

在實(shí)際的應(yīng)用中，SSR 標(biāo)記的分析步驟可以總結(jié)為兩步，即微衛(wèi)星引物的獲取與設(shè)計(jì)、SSR-PCR 擴(kuò)增與檢測。

2.1 微衛(wèi)星引物的獲取與設(shè)計(jì) 該步驟可以進(jìn)一步細(xì)化為獲取引物、使用近緣種引物、引物設(shè)計(jì)3 個(gè)環(huán)節(jié)。其中，在獲取引物中，可以提取所研究對(duì)象的已知SSR 兩翼序列/引物，或者在公共DNA 序列數(shù)據(jù)庫中提取。對(duì)于使用近緣種引物來說，由于屬內(nèi)種間和SSR 位點(diǎn)序列基本保守，因此有著較高的可行性。在引物設(shè)計(jì)中，可以依托同一物種間微衛(wèi)星兩側(cè)序列的保守程度高這一規(guī)律完成，從而達(dá)到同一物種（甚至可以為不同物種）其他基因型微衛(wèi)星片段的擴(kuò)增。在此環(huán)節(jié)中，需要構(gòu)建基因組DNA 文庫。

2.2 SSR-PCR 擴(kuò)增與檢測 在SSR 技術(shù)的應(yīng)用中，因?yàn)槭褂昧颂禺愋詳U(kuò)增，所以擴(kuò)增的穩(wěn)定性更好。需要注意的是，在不同引物中，（G+C）%含量存在一定的差異，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度也有所不同，所以應(yīng)當(dāng)針對(duì)所有引物設(shè)定擴(kuò)條件。同時(shí)，處于對(duì)結(jié)果明顯性、準(zhǔn)確性的考量，必須使用具備加高分辨率的聚丙酰胺凝膠電泳，并在實(shí)際擴(kuò)增過程中投入包含放射性標(biāo)記的dNTP，以確保顯示結(jié)果的質(zhì)量。

3 SSR 技術(shù)在果樹上的應(yīng)用

3.1 在果樹種質(zhì)資源研究方面的應(yīng)用 從當(dāng)前的情況來看，在果樹種質(zhì)資源研究方面，SSR 技術(shù)主要被應(yīng)用于鑒別品種真實(shí)性上，以此達(dá)到避免遺傳漂變、外來劃分授粉等問題的效果。同時(shí)，SSR 技術(shù)還被應(yīng)用于研究個(gè)體與群體之間的近緣程度，實(shí)現(xiàn)個(gè)體遺傳構(gòu)成的分析，并對(duì)群體內(nèi)的變異進(jìn)行區(qū)分。例如，使用SSR 技術(shù)展開多個(gè)葡萄品種、品系的鑒定，能夠辨別出其中具備相同擴(kuò)增片段的品種，并將其與其他品種進(jìn)行區(qū)別。在SSR 技術(shù)的支持下，還可以實(shí)現(xiàn)釀酒葡萄品種品本的鑒定。當(dāng)前，在柑橘珠心苗的研究中，SSR 技術(shù)被應(yīng)用在種質(zhì)鑒定方面，并取得了一定的成效。總體來說，SSR 技術(shù)在種質(zhì)資源的收集、保存、評(píng)價(jià)與利用中均發(fā)揮了極高的應(yīng)用價(jià)值。

在核果類果樹種質(zhì)資源的遺傳分析中，SSR 技術(shù)的應(yīng)用為種質(zhì)資源研究及品種鑒定提供了技術(shù)支持，從這一角度來說，在農(nóng)藝性狀標(biāo)記方面，SSR 技術(shù)能夠充分發(fā)揮作用。使用SSR 技術(shù)分析桃種間的親緣關(guān)系能夠發(fā)現(xiàn)，部分桃種間存在親緣關(guān)系，例如新疆桃與普通桃、甘肅桃與陜西桃等。在此基礎(chǔ)上，還可以獲取桃間的演化模式，為分子標(biāo)記輔助育種在桃栽植方面的有效應(yīng)用提供支持。

對(duì)于SSR 技術(shù)來說，其還可以應(yīng)用于跨種、跨屬的種質(zhì)資源研究。例如，利用SSR 技術(shù)可以明確柿屬植物分子進(jìn)化以及系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)內(nèi)容；利用SSR 技術(shù)分析果梅種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可以明確PCR 反應(yīng)體系的主要成分，結(jié)合對(duì)已知微衛(wèi)星序列展開同源性分析以及抗寒性鑒定（性能鑒定），能夠完成優(yōu)質(zhì)梅種質(zhì)的篩選。

3.2 在構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜方面的應(yīng)用 在當(dāng)前技術(shù)水平條件下，分子標(biāo)記遺傳圖譜的主要構(gòu)建技術(shù)為SSR 技術(shù)。對(duì)于果樹來說，其雜合程度較高、生長周期更長，且部分果樹存在孤雌生殖的特點(diǎn)，因此利用構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜完成標(biāo)記、定位、克隆經(jīng)濟(jì)形狀具有極高的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。目前，世界范圍內(nèi)已經(jīng)完成了超過500 個(gè)由SSR 標(biāo)記構(gòu)成的水稻分子連鎖圖，平均長度達(dá)到3.6 cm。

目前，農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展使得果樹研究成果頻出，構(gòu)建果樹分子標(biāo)記遺傳圖譜的速度也越來越快。在當(dāng)前的研究中，已經(jīng)構(gòu)建櫻桃、李子、桃等多種果樹種的遺傳連鎖圖譜，其中，普遍使用了SSR 技術(shù)進(jìn)行輔助標(biāo)記，核心技術(shù)為RFLP 技術(shù)。例如，依托存在于柑橘基因組文庫中的多對(duì)SSR 引物，補(bǔ)充已知柑橘遺傳圖譜（構(gòu)建方法為同工酶方法與RFLP 技術(shù)），實(shí)現(xiàn)了2 個(gè)連鎖圖的新增，其中包含8 個(gè)標(biāo)記。在構(gòu)建葡萄遺傳連鎖圖的過程中，應(yīng)用SSR 技術(shù)以及CAPS，可以得出某SSR 分子標(biāo)記與性別基因呈現(xiàn)出相對(duì)緊密的連鎖狀態(tài)，結(jié)合QTL 定位法能夠進(jìn)一步獲得與抗病基因保持連鎖狀態(tài)的分子標(biāo)記，為葡萄品種及其優(yōu)化提供支持。

4 結(jié)語

相比于RFLP 標(biāo)記技術(shù)以及RAPD 技術(shù)，SSR 技術(shù)擁有兩者的優(yōu)勢，能夠彌補(bǔ)后兩種技術(shù)的不足，且可在較短時(shí)間內(nèi)完成大規(guī)模的樣本分析，實(shí)用性更強(qiáng)，因此擁有更為廣闊的應(yīng)用前景。在當(dāng)前的果樹研究中，SSR 技術(shù)主要被應(yīng)用在果樹種質(zhì)資源研究方面以及構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜方面，且取得了很多研究成果，值得重點(diǎn)關(guān)注與探究。