日本米蝦胚胎發(fā)育及離體孵化*

曹林泉 秦 政 姜玉聲 劉 鑫 李曉東 林 源 黃楷濤 劉 胥

日本米蝦胚胎發(fā)育及離體孵化*

曹林泉1秦 政1姜玉聲1①劉 鑫1李曉東2林 源3黃楷濤1劉 胥2

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 大連 116023；2. 盤錦光合蟹業(yè)有限公司研發(fā)中心 盤錦 124200；3. 遼寧省水產(chǎn)苗種管理局 大連 116015)

本研究采用自制離體孵化裝置，對(duì)日本米蝦()不同發(fā)育期胚胎進(jìn)行離體孵化研究，結(jié)果顯示，水溫為25.5℃時(shí)，日本米蝦受精卵孵化大約需要25 d，發(fā)育積溫為637.5℃。胚胎發(fā)育歷經(jīng)受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、前無節(jié)幼體期、后無幼體期、前溞狀幼體期和膜內(nèi)溞狀幼體期8個(gè)時(shí)期。各期離體胚胎均能孵化出幼體，膜內(nèi)溞狀幼體期離體胚胎孵化率最高，為(80.7±2.4)%，非離體孵化的對(duì)照組為(79.1±4.9)%，二者差異不顯著；卵裂期離體胚胎孵化率最低，為(28.2±2.6)%，與對(duì)照組差異顯著。各組離體胚胎所孵化出的Ⅰ期(ZⅠ)和Ⅱ期溞狀幼體(ZⅡ)的變態(tài)率無顯著差異。溫度對(duì)日本米蝦前溞狀幼體期胚胎離體孵化影響顯著，在15.0℃~32.5℃范圍內(nèi)，隨水溫升高孵化時(shí)間逐漸縮短，15.0℃時(shí)，前溞狀幼體離體孵化時(shí)間為(436.8±124.8) h，32.5℃時(shí)縮短至(228.0±88.8) h，但溫度高于29.0℃時(shí)，孵化出的幼體變態(tài)率開始下降。本研究可為日本米蝦繁殖生物學(xué)及甲殼動(dòng)物胚胎離體孵化技術(shù)研究提供參考。

日本米蝦；胚胎發(fā)育；離體孵化；溫度

日本米蝦()，又稱大和藻蝦、珍珠蝦，隸屬于軟甲綱(Malacostraca)，十足目(Decapoda)，匙指蝦科(Atyidae)，米蝦屬()。其習(xí)性溫和，體色透明，喜食藻類和有機(jī)碎屑，具有洄游習(xí)性，對(duì)鹽度適應(yīng)性強(qiáng)，易于飼養(yǎng)，常作為水族箱中的“清道夫”以及生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料(Tlusty, 2002; 趙朝陽等, 2012; 高淑嬌, 2012; 蔡生力等, 2006; 李帆, 2007)。近年來，日本米蝦的市場需求量日益增加，價(jià)格逐年攀升，然而對(duì)其生物學(xué)的研究甚少。日本學(xué)者對(duì)此蝦的洄游等生物學(xué)習(xí)性進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)鹽度16.9，溫度25℃為胚胎發(fā)育的適宜條件，其幼體經(jīng)過9個(gè)時(shí)期發(fā)育成為仔蝦(Hamano, 1992; Hayashi, 1984)。國內(nèi)鮮有此蝦的相關(guān)報(bào)道，而對(duì)于沒有洄游習(xí)性、在淡水中繁殖的中華鋸齒米蝦()生物學(xué)相關(guān)研究較多(薛俊增等, 1995; 孫世杰等, 2007)。這2種米蝦胚胎發(fā)育等繁殖特性的差異有待進(jìn)一步研究。

腹胚亞目的蝦蟹類有抱卵習(xí)性，但在環(huán)境不適或受驚擾時(shí)會(huì)發(fā)生棄卵現(xiàn)象。一些人工繁殖的種類其親體在抱卵過程中會(huì)發(fā)生死亡，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，因此，蝦蟹類胚胎離體孵化技術(shù)研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值。閻斌倫(2002)的研究表明，蝦蟹受精卵與親體僅以剛毛連接，腹肢擺動(dòng)保證發(fā)育過程中氧氣充足，但沒有營養(yǎng)上的聯(lián)系。因此，在進(jìn)行蝦蟹類胚胎離體孵化時(shí)，研究者通常關(guān)注于水中的溶解氧，多采用充氣的方法。迄今，已有關(guān)于日本沼蝦()、中華絨螯蟹()等離體孵化的研究報(bào)道，但離體孵化的效果往往與胚胎離體的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(王吉橋等, 2006; 康現(xiàn)江等, 1996; 顧功超等, 1995)。也有研究者認(rèn)為，水中微生物及死卵滋生的原生動(dòng)物會(huì)影響離體胚胎的孵化率，嘗試使用化學(xué)藥物對(duì)胚胎及水體進(jìn)行消毒處理，但這一方法有可能會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生潛在的毒性，同時(shí)也會(huì)造成環(huán)境的污染(廖永巖等, 2001; 鮑鷹等, 1999)。如何能提高較早離體胚胎的孵化效果具有一定理論與應(yīng)用意義。

日本米蝦抱卵親體在胚胎臨近孵化的后期常出現(xiàn)棄卵現(xiàn)象，推測(cè)原因?yàn)榕咛グl(fā)育不同步，部分幼體先孵出后刺激親體去除剩卵?，F(xiàn)階段尚缺乏對(duì)日本米蝦胚胎發(fā)育的系統(tǒng)報(bào)道，限制了對(duì)棄卵機(jī)理的深入研究，而棄卵如何再利用也是需要解決的問題。本研究用自制水產(chǎn)動(dòng)物胚胎孵化裝置對(duì)不同時(shí)期胚胎進(jìn)行離體孵化，研究了日本米蝦的胚胎發(fā)育特征及溫度對(duì)其離體孵化效果的影響，以期為此種類繁殖生物學(xué)研究及甲殼動(dòng)物胚胎離體孵化技術(shù)的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于2017年2~4月在大連海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。日本米蝦購于廣州花地灣花鳥魚蟲批發(fā)市場，平均體長為(3.5±0.8) cm，平均體重為(4.9±0.9) g，經(jīng)促熟培育至產(chǎn)卵。養(yǎng)殖容器為9.0 L玻璃魚缸，配有溫度計(jì)、50 W加熱棒(閩江HK-50)、5 W水泵(森森JP-032)和氣石等輔助裝置。自制離體孵化裝置見圖1。

1.2 方法

1.2.1 胚胎形態(tài)學(xué)觀察 將抱卵親蝦挑出單獨(dú)飼養(yǎng)。抱卵后，前3 d每隔6 h取卵1次，以后每24 h取卵1次，取卵時(shí)將抱卵親蝦置于表面皿中，用解剖針輕輕將胚胎從附肢上剝離，再將粘連的胚胎分開，并及時(shí)放入已經(jīng)消毒的水中備用。每次隨機(jī)取胚胎4~5個(gè)，4組平行。使用Nikon E100顯微鏡觀察胚胎發(fā)育特征，測(cè)量胚徑，并拍照，最后計(jì)算發(fā)育積溫。發(fā)育積溫計(jì)算公式(周洲等, 2015)為：

發(fā)育積溫=胚胎發(fā)育天數(shù)×平均水溫

圖1 離體孵化裝置

1：滴水孔；2：孵化槽；3：調(diào)節(jié)閥；4：離體胚胎；5：水族缸；6：水泵

1: Drip water hole; 2: Incubator; 3: Regulating valve; 4: Embryo; 5: Aquarium; 6: Pump

1.2.2 胚胎離體孵化 離體孵化裝置中的水泵將水抽入管道，管道上有小孔，水從小孔噴灑到孵化槽中的濾棉上，其上放置離體胚胎(圖1)。將卵裂期、囊胚期、原腸胚、前無節(jié)幼體期、后無節(jié)幼體期、前溞狀幼體期和膜內(nèi)溞狀幼體期的胚胎分別置于離體孵化裝置，每組置有100個(gè)胚胎，同時(shí)在孵化裝置的玻璃缸中放入胚胎發(fā)育至相應(yīng)時(shí)期的抱卵親蝦。孵化期間鹽度為17.0±1.0，溫度為(25.5±1.0)℃，每組重復(fù)5次。

1.2.3 溫度對(duì)胚胎離體孵化的影響 設(shè)置15.0℃、18.5℃、22.0℃、25.5℃、29.0℃和32.5℃共6個(gè)溫度組，鹽度為17.0。每個(gè)溫度組在實(shí)驗(yàn)時(shí)，于離體孵化裝置中放入處于前溞狀幼體期的胚胎100個(gè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20進(jìn)行單因素方差分析和Turkey多重比較計(jì)算各數(shù)據(jù)間的差異顯著性，以<0.05作為顯著差異判定條件。

2 結(jié)果

2.1 胚胎發(fā)育分期與形態(tài)特征

日本米蝦產(chǎn)卵后由卵柄將卵粘在一起，抱于腹部。根據(jù)胚胎發(fā)育過程中形態(tài)學(xué)特征的變化，將胚胎發(fā)育過程分為受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸期、前無節(jié)幼體期、后無節(jié)幼體期、前溞狀幼體期和膜內(nèi)溞狀幼體期8個(gè)時(shí)期，各個(gè)發(fā)育期主要形態(tài)特征見表1。

表1 日本米蝦胚胎發(fā)育各時(shí)期特征

Tab.1 Characteristics of each embryonic developmental stage of C. japonica

受精卵(圖2A)：不規(guī)則橢圓形，呈深灰色，卵徑為(0.48±0.03) mm×(0.28±0.01) mm，4~6 h后進(jìn)入卵裂期。

卵裂期(圖2B、圖2C)：胚胎發(fā)育至卵裂期，呈深灰色，不透明。分裂過程中明顯可見卵裂溝。新分裂的2個(gè)細(xì)胞中央顏色較深，充滿整個(gè)胚胎內(nèi)。卵裂期階段持續(xù)約36 h。

囊胚期(圖2D)：產(chǎn)卵后42 h，胚胎發(fā)育進(jìn)入囊胚期，此期胚胎邊緣顏色變淺，中央顏色加深。胚徑與受精卵相當(dāng)。囊胚期胚胎內(nèi)分化出大量小細(xì)胞，胚胎表面細(xì)胞呈多邊形且排列緊密，形狀如同桑葚。由于分裂的細(xì)胞較小，無法區(qū)分植物極、動(dòng)物極與囊胚腔。

原腸期(圖2E)：產(chǎn)卵后96 h，胚胎發(fā)育進(jìn)入原腸期，此時(shí)陰影區(qū)域外圈顏色變淺至半透明，中央顏色也略變淺，呈淺灰色。隨著胚胎發(fā)育，透明區(qū)域擴(kuò)大到整個(gè)胚胎的1/4后開始發(fā)育形成腹板。胚徑明顯增大，為(0.52±0.03) mm×(0.33±0.01) mm。胚體不斷吸收利用卵黃，胚胎細(xì)胞繼續(xù)分裂，細(xì)胞數(shù)量更多更加微小。胚胎的一端出現(xiàn)月牙狀透明區(qū)域，為進(jìn)入原腸期的重要標(biāo)志。

前無節(jié)幼體期(圖2F)：產(chǎn)卵后192 h，胚胎發(fā)育進(jìn)入前無節(jié)幼體期，該期僅持續(xù)24 h。此期胚胎一端的透明區(qū)域約占整個(gè)受精卵的1/3，陰影區(qū)域與透明區(qū)域相連接的位置出現(xiàn)凹陷，陰影區(qū)域顏色變淺，僅中央部分呈深灰色，其他部分均呈半透明。透明區(qū)域出現(xiàn)分節(jié)現(xiàn)象，將發(fā)育為幼體的腹部。陰影區(qū)域開始積累復(fù)眼色素，將發(fā)育為復(fù)眼。卵徑略有增大，為(0.55±0.01) mm×(0.35±0.01) mm。

后無節(jié)幼體期(圖2G)：產(chǎn)卵后216 h進(jìn)入后無節(jié)幼體期，此期胚胎卵黃繼續(xù)縮小，透明區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，約占胚胎的1/2。卵徑與前無節(jié)幼體期相當(dāng)。本期胚胎中出現(xiàn)明顯可見的黑色復(fù)眼，為胚胎進(jìn)入后無節(jié)幼體期的重要標(biāo)志。胚胎腹部透明區(qū)域隱約出現(xiàn)1個(gè)棒狀結(jié)構(gòu)，未來發(fā)育成腸道，出現(xiàn)5對(duì)附肢，但不分節(jié)。約48 h后，頭部及胸部出現(xiàn)分化，腹部分節(jié)進(jìn)一步明顯，附肢及腸道進(jìn)一步分化，附肢數(shù)目增加為7對(duì)。

前溞狀幼體期(圖2H)：胚胎發(fā)育288 h進(jìn)入前溞狀幼體期，由于卵黃持續(xù)減少，胚胎顏色進(jìn)一步變淺，幾乎為半透明狀。卵徑與前無節(jié)幼體期相當(dāng)。此期隱約可見分節(jié)，復(fù)眼增大，頭部及胸部進(jìn)一步發(fā)育分化，頭部出現(xiàn)彎曲的條狀結(jié)構(gòu)，將發(fā)育成額角，胸部出現(xiàn)類似心臟的組織，并不規(guī)律的跳動(dòng)，為胚胎進(jìn)入前溞狀幼體期的重要標(biāo)志，心跳60~100次/min，有心跳間隔，此時(shí)胚胎發(fā)育積溫約達(dá)到306.0℃。72.0 h后心跳逐漸穩(wěn)定，心跳間隔出現(xiàn)次數(shù)減少，心跳約為100次/min。

圖2 日本米蝦胚胎發(fā)育各時(shí)期的形態(tài)特征

A：受精卵；B、C：卵裂期；D：囊胚期；E：原腸期；F：前無節(jié)幼體期；G：后無節(jié)幼體期；H：前溞狀幼體期；I：膜內(nèi)溞狀幼體期；J：溞狀幼體I期；N：細(xì)胞核；YK：卵黃；CE：復(fù)眼；VP：腹板；AS：附肢；AC：消化道；HT：心臟

A: Fertilized eggs; B, C: Cleavage stage; D: Blastula stage; E: Gastrula stage; F: Pre-nauplii stage; G: Metanauplius stage; H: Before-zoea stage; I: Membrane-zoea stage; J: Zoea I stage; N: Nuclei; YK: Yolk; CE: Compound eyes; VP: Ventral plate; AS: Appendages; AC: Alimentary canal; HT: Heart

膜內(nèi)溞狀幼體期(圖2I)：雌蝦產(chǎn)卵后408 h進(jìn)入膜內(nèi)溞狀幼體期，此時(shí)卵黃僅存少量于胚體的頭胸部背面，透明區(qū)域幾乎充滿整個(gè)胚胎。卵徑增大明顯，為(0.63±0.03) mm×(0.39±0.02) mm。復(fù)眼發(fā)育成亮黑色，四周隱約出現(xiàn)放射狀條紋，出現(xiàn)眼柄，復(fù)眼呈半球狀突出于背部表面。頭部額角變粗，頭胸部附肢分節(jié)，附肢末端出現(xiàn)色素塊。胚胎組織結(jié)構(gòu)清晰可見，腸道發(fā)育完全，偶爾可見蠕動(dòng)。身體仍然彎曲，偶見抽動(dòng)。膜內(nèi)溞狀幼體期胚胎心臟發(fā)育日趨完全，心跳穩(wěn)定且加快，不再出現(xiàn)心跳間隔。此時(shí)胚胎發(fā)育基本完成，體型與溞狀幼體類似。

溞狀幼體Ⅰ期(圖2J)：胚胎發(fā)育至600 h左右，發(fā)育積溫達(dá)到637.5℃，心跳增加到約180次/min，陸續(xù)開始有幼體孵出，幼體破膜時(shí)用頭部的額角及附肢刺破卵膜。出膜后的幼體游泳能力弱，頭部垂直向下，隨水流而浮動(dòng)。自此，日本米蝦完成胚胎發(fā)育階段，將進(jìn)入幼體變態(tài)發(fā)育階段。

2.2 不同時(shí)期的胚胎離體孵化效果

水溫25.5℃時(shí)，不同時(shí)期離體胚胎均能于離體孵化裝置中孵出幼體，但孵化率有較大差異(表2)。卵裂期離體胚胎孵化率為(28.2±2.6)%，囊胚期離體胚胎孵化率為(33.1±4.4)%，二者無顯著差異(>0.05)；前無節(jié)幼體期離體胚胎孵化率為(64.9±6.5)%，后無節(jié)幼體期離體胚胎的孵化率為(66.8±13.2)%，其無顯著差異(>0.05)，但與非離體孵化的對(duì)照組(79.1±4.9)%差異顯著(<0.05)。前溞狀幼體期胚胎的離體孵化率為(78.9±2.2)%，膜內(nèi)溞狀幼體期孵化率為(80.7±2.4)%，與對(duì)照組差異不顯著(>0.05)。各組離體胚胎所孵化出的Ⅰ期溞狀幼體(ZⅠ)到Ⅱ期溞狀幼體(ZⅡ)的變態(tài)率無顯著差異(>0.05)。

表2 不同發(fā)育期胚胎離體孵化效果

Tab.2 Effects of embryo incubation in vitro on different developmental stages

注：同行中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(>0.05)；ZⅠ表示溞狀幼體Ⅰ期；ZⅡ表示溞狀幼體期，下同

Note: The data with different letters within the same row are significantly different at the 0.05 probability level, and the data with the same letters within the same row are not significantly different; the ZⅠrepresents the 1st phase of the zoea larva; ZⅡrepresents the 2nd phase of the zoea larva. The same as below

2.3 溫度對(duì)離體孵化效果的影響

由表3可知，當(dāng)鹽度為17.0時(shí)，不同溫度組日本米蝦前溞狀幼體期胚胎離體孵化時(shí)間和孵化率有明顯差異。從15.0℃到32.0℃，隨著水溫的升高，胚胎孵化時(shí)間逐漸縮短，15.0℃組孵化時(shí)間需要(436.8± 124.8) h，而32.0℃組縮短至(228.0±88.8) h。溫度對(duì)胚胎離體孵化率有顯著影響，從15.0℃到29.0℃，隨著水溫升高而呈逐漸升高趨勢(shì)，29.0℃時(shí)孵化率最高，為(78.2±2.8)%，但在32.5℃時(shí)下降至(73.2±3.2)%。由此可知，溫度過高或過低均不利于離體胚胎的發(fā)育與孵化。

溫度對(duì)離體孵化出幼體的質(zhì)量也有影響。25.5℃組中溞狀幼體變態(tài)率最高，為(67.2±1.8)%，32.5℃組溞狀幼體變態(tài)率最低，為(57.3±4.0)%，與其他各組均有顯著差異(<0.05)；15.0℃、18.5℃、22.0℃3組間溞狀幼體變態(tài)率差異不顯著(>0.05)。綜合孵化率和溞狀幼體變態(tài)率，胚胎離體孵化溫度控制在25.5℃到29.0℃間，有利于提高孵化率和幼體質(zhì)量。

3 討論

3.1 胚胎發(fā)育的分期

蝦蟹類胚胎發(fā)育可分為胚胎早期和晚期2個(gè)主要階段，早期階段為卵裂期、囊胚期和原腸胚；而晚期階段也就是絕大部分蝦蟹具有的膜內(nèi)幼體期，其因種類而異，分期尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。適宜的條件下，錦繡龍蝦()膜內(nèi)幼體期為14~15 d，根據(jù)附肢數(shù)量和復(fù)眼色素形成等特征分為7對(duì)附肢期、 9對(duì)附肢期、11對(duì)附肢期、復(fù)眼色素形成期、準(zhǔn)備孵化期和孵化期(梁華芳等, 2012)；白須條斑鞭腕蝦()膜內(nèi)幼體期約為8.5 d，根據(jù)復(fù)眼色素形成和心跳等特征分為無節(jié)幼體發(fā)生期、復(fù)眼色素形成前期、復(fù)眼色素形成后期、孵化前期和孵化期(張雅靜等, 2012)；遠(yuǎn)海梭子蟹()的膜內(nèi)幼體期也為8.5 d左右，但根據(jù)身體分節(jié)和心跳等特征僅分為無節(jié)幼體、后無節(jié)幼體和原溞狀幼體(廖永巖等, 2011)。對(duì)中華新米蝦的研究表明，其胚胎發(fā)育分為卵裂期、囊胚期、原腸期、無節(jié)幼體期Ⅰ、無節(jié)幼體期Ⅱ、無節(jié)幼體Ⅲ期和無節(jié)幼體Ⅳ期，在水溫為22℃~26℃條件下發(fā)育歷時(shí)376 h (薛俊增等, 2009)。也有研究者將中華鋸齒米蝦的胚胎發(fā)育分為卵裂期、囊胚期、原腸期、前無節(jié)幼體期、后無節(jié)幼體期、復(fù)眼色素形成期和溞狀幼體期(孫世杰等, 2007)。本研究參考已報(bào)道的蝦蟹類胚胎分期方法(薛俊增等, 2009; 徐慈浩等, 2015)，將日本米蝦早期胚胎分為受精卵、卵裂期、囊胚期和原腸胚期，而將晚期胚胎分為前無節(jié)幼體期、后無節(jié)幼體期、前溞狀幼體期和膜內(nèi)溞狀幼體期。日本米蝦胚胎發(fā)育過程與中華新米蝦等大多數(shù)淡水蝦類胚胎發(fā)育特征相似，其發(fā)育時(shí)間長，膜內(nèi)幼體期多。但多數(shù)淡水蝦類孵化出的幼體直接或者經(jīng)過短暫的變態(tài)發(fā)育進(jìn)入仔蝦期(薛俊增等, 1995; 孫世杰等, 2007; 劉哲玉, 2009)，日本米蝦幼體孵化后要經(jīng)歷較長的浮游期，這一點(diǎn)又與多數(shù)海水蝦類相似(蔡生力等, 2006; 季文娟, 1996; 梁俊平, 2013)。日本米蝦的胚胎發(fā)育及幼體的行為表現(xiàn)兼具淡水和海水種類的特征，與其降河洄游特性相一致。

表3 不同溫度下離體胚胎孵化效果

Tab.3 Effects of water temperature on in vitro embryo hatching performance

3.2 不同發(fā)育時(shí)期胚胎離體孵化的效果

蝦蟹類胚胎離體孵化過程中除了要保證足夠的溶解氧，最主要的影響因素來自于真菌和原生動(dòng)物等有害生物的滋生，由于沒有親體的及時(shí)清理，大量的有害生物附著于胚胎表面，導(dǎo)致胚胎腐爛，或被這些生物直接進(jìn)食。為提高胚胎的離體孵化率，不少研究者使用藥物處理胚胎。廖永巖等(2001)研究表明，使用0.2 mg/dm3濃度的孔雀石綠處理遠(yuǎn)海梭子蟹離體卵效果顯著；鮑鷹等(1999)對(duì)中華絨螯蟹胚胎離體孵化研究表明，福爾馬林與孔雀石綠聯(lián)用比其單獨(dú)使用的效果明顯。雖然使用藥物處理離體胚胎取得了一定成果，但規(guī)?；a(chǎn)中這無疑將增加生產(chǎn)成本，且很多作用明顯的化學(xué)藥物會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害，已被列入禁用藥品。本研究沒有使用任何藥物處理離體胚胎，獲得了較好的孵化效果，這主要取決于裝置的持續(xù)流水，以及精細(xì)的過濾裝置，其不僅能保證充足的溶解氧，及時(shí)沖洗胚胎表層的有害生物，而且能將水中的懸浮物濾除，減少細(xì)菌或原生動(dòng)物對(duì)胚胎的影響。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)水流過大易擊破卵膜，過小又不能徹底清除有害生物，水流大小對(duì)胚胎孵化效果的影響需要進(jìn)一步研究。

日本米蝦各階段胚胎均能夠離體孵化出幼體，且所孵出的ZⅠ幼體均能夠發(fā)育至ZⅡ幼體，其與抱卵親蝦所孵出幼體的變態(tài)率無顯著差異，表明本研究所采用的胚胎離體孵化裝置及操作對(duì)幼體質(zhì)量無顯著影響。因此，本實(shí)驗(yàn)裝置經(jīng)過規(guī)模放大及適當(dāng)?shù)募夹g(shù)優(yōu)化可以滿足生產(chǎn)需求，對(duì)抱卵過程中因親體死亡而廢棄的受精卵重新利用，為蝦蟹人工育苗技術(shù)創(chuàng)新提供參考。

3.3 溫度對(duì)日本米蝦胚胎離體孵化效果的影響

蝦蟹類生長繁育中溫度是重要環(huán)境因子，不僅影響其抗逆能力(馮亞萍等, 2018)和生長性狀(王明珠等, 2018)，更對(duì)胚胎發(fā)育起決定性作用，但迄今有關(guān)溫度對(duì)蝦蟹離體胚胎發(fā)育及孵化效果影響的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，在15.0℃~32.0℃范圍內(nèi)，日本米蝦的離體孵化胚胎孵化時(shí)間逐漸縮短，15.0℃組孵化需要(436.8±124.8) h，而32.0℃組縮短至(228±88.8) h。在15.0℃~29.0℃范圍內(nèi)，孵化率也隨著水溫的升高而呈上升趨勢(shì)，但溫度高于29.0℃時(shí)，孵化率和幼體的變態(tài)率會(huì)明顯下降。已有研究表明，在19.0℃~31.0℃范圍內(nèi)，脊尾白蝦()胚胎發(fā)育時(shí)間隨溫度升高而縮短，但高于28.0℃時(shí)隨著溫度升高幼體存活率開始下降，達(dá)到36.0℃時(shí)幼體無法變態(tài)(梁俊平等, 2013)。這可能由于溫度升高導(dǎo)致胚胎代謝加快，機(jī)體發(fā)育時(shí)各組織器官發(fā)育又不完善，造成各器官的衰竭。另外，與機(jī)體代謝相關(guān)的酶及其他大分子物質(zhì)的活性也均受到溫度影響，過高的溫度可能會(huì)直接導(dǎo)致其功能受損。水生生物胚胎通常要達(dá)到一定的積溫才能孵化，本研究計(jì)算了日本米蝦離體孵化的積溫，約為637.5℃，與錦繡龍蝦的642.4℃相近(梁華芳等, 2012)，但遠(yuǎn)高于一般蝦蟹的300.0℃~ 400.0℃(蔡生力等, 2006; 顧功超等, 1995)。人工繁育時(shí)應(yīng)建立起孵化溫度、孵化率和幼體質(zhì)量間的平衡，在保證胚胎正常發(fā)育和幼體質(zhì)量的前提下，參考積溫?cái)?shù)值，利用溫度調(diào)控胚胎發(fā)育時(shí)間，以合理安排生產(chǎn)計(jì)劃，降低生產(chǎn)成本。

Bao Y, Liu J, Lin SJ. Study on the breeding of in vitro embryo ofmitten crab (). Marine Sciences, 1999(1): 55–58 [鮑鷹, 劉軍, 林少軍. 中華絨螯蟹受精卵離體培育的初步研究. 海洋科學(xué), 1999(1): 55–58]

Cai SL, Chen Y. Research status of marine ornamental crust- aceans. Scientific Fish Farming, 2006(1): 2–4 [蔡生力, 陳巖. 海洋觀賞性甲殼類的研究現(xiàn)狀. 科學(xué)養(yǎng)魚, 2006(1): 2–4]

Feng YP, Kong J, Luo K,. The difference of tolerance to white spot syndrome virus betweenandat different temperatures. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(2): 120–127 [馮亞萍,孔杰, 羅坤, 等. 不同溫度下凡納濱對(duì)蝦和中國明對(duì)蝦對(duì)白斑綜合征病毒(WSSV)耐受性比較. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(2): 120–127]

Gao SJ. Characteristics and development prospect of several ornamental shrimp species. Fujian Agricultural Science and Technology, 2012(3–4): 129–131 [高淑嬌. 幾種觀賞蝦的特征特性及開發(fā)前景. 福建農(nóng)業(yè)科技, 2012(3–4): 129– 131]

Gu GC, Huang XX, Tan ZQ. Artificial hatching of isolated eggs ofand its application. Fishery Modernization, 1995(5): 11–14 [顧功超, 黃旭雄, 譚正啟. 中華絨螫蟹離體卵的人工孵化及其利用. 漁業(yè)現(xiàn)代化, 1995(5): 11–14]

Hamano T. Ecology of an atyid shrimp(De Man, 1892) migrating to upstream habitats in the Shiwagi rivulet, Tokushima Prefecture. Researches on Crustacea, 1992, 21: 1–13

Hayashi KI, Hamano T. The complete larval development ofDe Man (Decapoda, Caridea, Atyidae) reared in the laboratory. Zoological Science, 1984, 1(4): 571–589

Ji WJ. Fatty acids changes during larval development of. Journal of Fishery Sciences of China, 1996, 3(4): 28–34 [季文娟. 中國對(duì)蝦()幼體發(fā)育各階段脂肪酸組成的研究. 中國水產(chǎn)科學(xué), 1996, 3(4): 28–34]

Kang XJ, Sun TC, Wang SA. Preliminary study on the isolated culture of the fertilized egg and embryonic development of the(Crustacea Decapoda). Journal of Hebei University (Natural Science), 1996(4): 44–48 [康現(xiàn)江, 孫天才, 王所安. 日本沼蝦受精卵的離體培養(yǎng)及其胚胎發(fā)育的初步觀察. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 1996(4): 44–48]

Li F. Prospects for the development of freshwater ornamental shrimp. Aquarium, 2007(6): 52–55 [李帆. 淡水觀賞蝦開發(fā)展望. 水族世界, 2007(6): 52–55]

Liang HF, He JG. Study on the artificial propagation and embryonic development of. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(2): 236–245 [梁華芳, 何建國. 錦繡龍蝦人工繁殖和胚胎發(fā)育的研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(2): 236–245]

Liang JP, Li J, Li JT,. Effects of water temperature on the embryonic development, survival and development period of larvae of ridgetail white prawn () reared in the laboratory. Acta Ecologica Sinica, 2013, 33(4): 1142–1152 [梁俊平, 李健, 李吉濤, 等. 不同溫度對(duì)脊尾白蝦胚胎發(fā)育與幼體變態(tài)存活的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 33(4): 1142–1152]

Liang JP. Study on the technology of artificial breeding and expression of genes involving in reproducing ofDoctoral Dissertation of Ocean University of China, 2013 [梁俊平. 脊尾白蝦全人工繁育及繁殖相關(guān)基因的研究. 中國海洋大學(xué)博士研究生學(xué)位論文, 2013]

Liao YY, Li F, Dong XX. External morphological characteristics during the embryonic development of. Zoological Research, 2011, 32: 657–662 [廖永巖, 李鋒, 董學(xué)興. 遠(yuǎn)海梭子蟹胚胎發(fā)育觀察. 動(dòng)物學(xué)研究, 2011, 32: 657–662]

Liao YY, Zhao LM. Hatching and larval culture ofembryo ofunder anti-fungus. Journal of Oceanography in Taiwan Strait, 2001, 20(3): 363–370 [廖永巖, 趙麗梅. 抗真菌藥物對(duì)遠(yuǎn)海梭子蟹離體胚胎(卵)孵化及幼體培育的影響. 臺(tái)灣海峽, 2001, 20(3): 363–370]

Liu ZY. The early development and vitellin levels of the crayfish,. Master′s Thesis of Hebei University, 2009 [劉哲玉. 克氏原螯蝦早期發(fā)育及卵黃蛋白含量的研究. 河北大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2009]

Sun SJ, Fan CG, Li FC,. Preliminary study on the conformation development of. Hebei Fishery, 2007(12): 22–25 [孫世杰, 范成功, 李鳳超, 等. 中華鋸齒米蝦形態(tài)發(fā)育的初步研究. 河北漁業(yè), 2007(12): 22–25]

Tlusty M. The benefits and risks of aquacultural production for the aquarium trade. Aquaculture, 2002, 205(3–4): 203–219

Wang JQ, Liu J, Jiang JY,. Morphological observation of egg envelops and pleopods and egg attachment in Chinese mitten-handed crab (). Chinese Journal of Fisheries, 2006, 19(2): 32–36 [王吉橋, 劉晶, 姜靜穎, 等. 中華絨螯蟹卵膜和腹肢的形態(tài)及卵附著機(jī)制. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2006, 19(2): 32–36]

Wang MZ, Meng XH, Kong J,. Evaluation of genetic parameters for growth and cold tolerance traits inunder low-temperature stress. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(3): 96–102 [王明珠, 孟憲紅, 孔杰, 等. 低溫脅迫條件下中國明對(duì)蝦生長性狀和耐低溫性狀的遺傳參數(shù)評(píng)估. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(3): 96–102]

Xu CH, Xiao RY, Mu LL,. Observation on development ofembryos and influence of temperature on embryonic development. Guangdong Agricultural Sciences, 2015, 42(20): 112–117 [徐慈浩, 肖銳媛, 木亮亮, 等. 羅氏沼蝦胚胎發(fā)育觀察及溫度對(duì)胚胎發(fā)育的影響. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 42(20): 112–117]

Xue JZ, Du NS. Crustacea. Shanghai: Shanghai Education Publishing House, 2009 [薛俊增, 堵南山. 甲殼動(dòng)物學(xué). 上海: 上海教育出版社, 2009]

Xue JZ, Zheng L, Chen ZF. Primary study of the embryo development of. Journal of Hangzhou Teachers Colloege, 1995(6): 79–83 [薛俊增, 鄭璐, 陳樟福. 中華新米蝦胚胎發(fā)育的初步研究. 杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào), 1995(6): 79–83]

Yan BL. Causes of the shedding of fertilized eggs and prevention measures. China Fisheries, 2002(7): 50–51 [閻斌倫. 河蟹受精卵脫落的原因與預(yù)防措施. 中國水產(chǎn), 2002(7): 50–51]

Zhang YJ, Cai SL, Liu H. Morphological observation of embryonic development of marine ornamental shrimp (). Journal of Fishery Sciences of China, 2012, 19(6): 923–929 [張雅靜, 蔡生力, 劉紅. 海洋觀賞蝦類清潔蝦胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2012, 19(6): 923–929]

Zhao CY, Zhang YN. Industrialized exploitation and prospect of ornamental shrimp in China. Chinese Fisheries Economics, 2012, 30(1): 83–87 [趙朝陽, 張亞楠.中國觀賞蝦的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)及展望. 中國漁業(yè)經(jīng)濟(jì), 2012, 30(1): 83–87]

Zhou Z，Li ZY，Zhang LT,. The study on relationship of cumulative temperature and the sex gland development of sturgeon in artificial breeding condition. Guizhou Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2015, 39(5): 65–68 [周洲, 李正友, 張龍濤, 等. 人工培育條件下鱘魚性腺發(fā)育積溫的研究. 貴州畜牧獸醫(yī), 2015, 39(5): 65–68]

Embryonic Development ofandIncubation of Its Fertilized Eggs

CAO Linquan1, QIN Zheng1, JIANG Yusheng1①, LIU Xin1, LI Xiaodong2, LIN Yuan3, HUANG Kaitao1, LIU Xu2

(1. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023; 2. Research and Development Center, Panjin Guanghe Crab Industrial Company Ltd, Panjin 124200; 3. Liaoning Provincial Aquatic Seeds Management Bureau, Dalian 116015)

In this study,eggs at different developmental stages were incubatedwithin a self-made incubator. The goal was to provide a reference for research onreproductive biology and crustacean embryohatching technology. The results showed thatfertilized eggs took about 25 days to hatch into larvae at a water temperature of 25.5℃ and the developmental accumulated temperature reaches about 637.5℃. The embryonic development went through eight stages: Fertilized eggs, cleavage stage, blastula stage, gastrula stage, embryonized nauplius stage, embryonized metanauplius stage, embryonized protozoea stage, and embryonized zoea stage. The embryos at different developmental stages could hatch to zoea larvae and can develop normally. The maximumhatching rate was (80.7±2.4)% found in eggs at embryonized zoea stage, which was not significantly different from that observed in normal ovigerous females (79.1±4.9)%. The minimumhatching rate was (28.2±2.6)%, found in eggs at cleavage stage, which was significantly lower than that of normal ovigerous females. Water temperature had a marked effect on embryonic development usinghatching method. Incubation time gradually decreased with increasing temperature at a range from 15.0℃ to 32.5℃, i.e., where (436.8±124.8) h at 15.0℃, (228.0±88.8) h at 32.5℃. However, the metamorphosis rate from ZⅠ to ZⅡ began to decline when water temperature exceeded 29.0℃.

; Embryonic development;incubation; Temperature

S966.12

A

2095-9869(2020)01-0145-08

10.19663/j.issn2095-9869.20181019001

* 遼寧省高等學(xué)校海洋產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院項(xiàng)目、遼寧省海洋與漁業(yè)廳計(jì)劃項(xiàng)目(2015013)、大連市杰出青年科技人才項(xiàng)目(2017RJ10)和大連海洋大學(xué)蔚藍(lán)英才工程資助項(xiàng)目共同資助[This work was supported by Liaoning Provincial Institute of Marine Industry Technology Research Project, Liaoning Provincial Ministry of Oceans and Fisheries Plan Project (2015013), Dalian Outstanding Youth Science and Technology Talent Project (2017RJ10), and Blue Ocean Talent Project of Dalian Ocean University]. 曹林泉，E-mail: lqcao0225@163.com

姜玉聲，副教授，E-mail: jys@dlou.edu.cn

2018-10-19,

2018-11-20

http://www.yykxjz.cn/

曹林泉, 秦政, 姜玉聲, 劉鑫, 李曉東, 林源, 黃楷濤, 劉胥. 日本米蝦胚胎發(fā)育及離體孵化. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(1): 145–152

Cao LQ, Qin Z, Jiang YS, Liu X, Li XD, Lin Y, Huang KT, Liu X. Embryonic development ofandincubation of its fertilized eggs. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 145–152

JIANG Yusheng, E-mail: jys@dlou.edu.cn

(編輯 馬璀艷)