一種富氧溫控型骨組織工程材料的構(gòu)建及性能評(píng)價(jià)

王宇清，劉國(guó)輝，劉長(zhǎng)安，康強(qiáng)軍，王凌云，任維娜，鞏進(jìn)平

在現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)條件下，由于高能爆炸性武器的應(yīng)用和火器傷本身復(fù)雜性的原因，戰(zhàn)創(chuàng)傷性的骨缺損發(fā)生率較高，且治療非常困難。如何高效地修復(fù)并重建此類損傷所導(dǎo)致的骨缺損、骨不連甚至骨壞死已成為目前骨科研究的重點(diǎn)課題[1-2]。雖然應(yīng)用自體骨移植修復(fù)骨缺損是目前臨床最可靠的治療方法，但是自體骨移植的并發(fā)癥嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用[3]。因此，應(yīng)用組織工程學(xué)原理構(gòu)建各種骨移植替代材料成為目前骨缺損治療的趨勢(shì)[4-5]。然而，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)，由于骨組織工程材料體積較大或血管化慢的原因，損傷后骨缺損及周圍組織早期的低氧環(huán)境無法改善，從而導(dǎo)致修復(fù)效果變差[6-8]。而且，低氧環(huán)境會(huì)嚴(yán)重阻礙骨的再生，不利于支架內(nèi)種子細(xì)胞的存活，從而在很大程度上限制了材料修復(fù)骨缺損效能的發(fā)揮。因此構(gòu)建一種能夠釋放氧氣于骨缺損部位的富氧骨移植替代材料，改善材料移植后早期的低氧環(huán)境是促進(jìn)骨缺損修復(fù)的新希望。1-溴十七氟辛烷作為一種全氟碳化合物，其具有良好的儲(chǔ)氧和釋氧能力，在血液組織工程領(lǐng)域已被用于臨床試驗(yàn)[9]。然而，將其應(yīng)用于骨組織工程學(xué)研究尚未見報(bào)道。另外，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)將殼聚糖(CS)、β-甘油磷酸鈉(β-GP)和羥乙基纖維素(HEC)按照一定的比例混合，可以構(gòu)建一種在體溫(37℃)條件下凝固的水凝膠[10]，其無毒無害，具有可降解性、生物相容性、緩釋性等多種優(yōu)點(diǎn)，在骨組織工程領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[11-12]。本實(shí)驗(yàn)首次構(gòu)建了不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料，并檢測(cè)和比較其一般理化特性和釋氧能力等，對(duì)表現(xiàn)較好的一組進(jìn)行掃描電鏡、細(xì)胞毒性、組織相容性等檢測(cè)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 1-溴十七氟辛烷(美國(guó)Sigma公司)；高脫乙酰度CS(美國(guó)Sigma公司)；β-GP(美國(guó)Sigma公司)；HEC(中國(guó)阿拉丁)；蛋黃卵磷脂(中國(guó)索萊寶)；超聲乳化儀(美國(guó)Sonics公司)；高壓氧艙(白求恩國(guó)際和平醫(yī)院)；恒溫水浴槽(中國(guó)成都儀器廠)；電子pH檢測(cè)儀(中國(guó)上海儀電公司PHS-3C型)；CG 8+型血?dú)夥治鱿到y(tǒng)(美國(guó)雅培公司)；掃描電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)；分光光度儀(中國(guó)雷杜生命科技)；光學(xué)電子顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(日本尼康ECLIPSE100型)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料的制備

1.3.1.11-溴十七氟辛烷濃度為5%的富氧溫控型骨組織工程材料：A液配置方法為CS粉劑0.75 g溶于25 ml濃度為0.1 mol/L的鹽酸溶液中，與β-GP粉劑1.725 g溶于去離子水10 ml混合，充分?jǐn)嚢柚敝粱旌弦和该鳎?℃冰箱中靜置過夜充分溶解后，先后用1.2 μm和0.22 μm的超濾膜加壓過濾除菌，密封后4℃保存?zhèn)溆谩液的配置：按照我們以往經(jīng)驗(yàn)，蛋黃卵磷脂95 mg加入Tyrode鹽緩沖液850 μl中，用超聲乳化儀乳化2次，每次1 min，得到輔助乳化液備用。將1-溴十七氟辛烷原液150 μl與上述輔助乳化液混合后，用超聲乳化儀乳化10次,每次1 min，得到1 ml 15%的1-溴十七氟辛烷乳液，用0.8 μm的超濾膜加壓過濾除菌后，高壓氧艙內(nèi)充分充氧，密封后4℃保存?zhèn)溆?。C液的配置：HEC粉末0.375 g溶于去離子水10 ml中，在室溫環(huán)境下，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，?.22 μm的超濾膜加壓過濾除菌，密封后4℃保存?zhèn)溆?。最后，將上述A、B、C三種液體，按照4∶2.5∶1的體積比例，在無菌臺(tái)上充分混合后，制備得到1-溴十七氟辛烷濃度為5%的富氧溫控型骨組織工程材料原液，密封后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.21-溴十七氟辛烷濃度為10%的富氧溫控型骨組織工程材料：按照上述方法分別配置A和C兩種基礎(chǔ)溶液，通過改變上述B液配方中1-溴十七氟辛烷原液的比例，得到1 ml 30%的1-溴十七氟辛烷乳液(B1液)，用0.8 μm的超濾膜加壓過濾除菌后，高壓氧艙內(nèi)充分充氧，密封后4℃保存?zhèn)溆?。最后，將上述A、B1、C三種液體，按照4∶2.5∶1的體積比例，在無菌臺(tái)上充分混合后，制備得到1-溴十七氟辛烷濃度為10%的富氧溫控型骨組織工程材料原液，密封后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2體溫下凝固時(shí)間的測(cè)定：將5%和10%濃度的1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料原液置于凍存管內(nèi)(n=10)，于37℃環(huán)境下進(jìn)行倒置。完全凝固的標(biāo)準(zhǔn)為：將材料放入37℃環(huán)境下開始計(jì)時(shí)，30 s觀察1次，觀察方式為將凍存管90°倒置，以30 s內(nèi)凝固的膠凍肉眼下無變形為完全凝固，該時(shí)間標(biāo)記為凝固時(shí)間。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取均值記錄2種濃度材料的凝固時(shí)間。

1.3.3pH值測(cè)定:在室溫下(約25℃左右)，用電子pH檢測(cè)儀測(cè)量5%和10%濃度的1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料原液的pH值，每組測(cè)量5個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量5次，取均值記錄2種濃度材料原液的pH值。

1.3.4釋氧曲線的測(cè)定:在37℃環(huán)境下，制備2種不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料于凍存管內(nèi)(n=5)，每支試管內(nèi)材料體積均為1 cm×1 cm×1 cm，然后往各個(gè)試管內(nèi)加入10 ml的Tyrode鹽緩沖液，試管密封后，置于37℃恒溫水浴槽內(nèi)，放置10 d，每天同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)于各個(gè)試管內(nèi)提取少量浸提液用CG 8+型血?dú)夥治鱿到y(tǒng)檢測(cè)氧分壓，取均值記錄并繪制釋氧曲線。

1.3.5掃描電鏡觀察：選取較優(yōu)釋氧性能的富氧溫控型骨組織工程材料，經(jīng)過多聚甲醛固定、沖洗、抽真空脫水凍干后，修裁出樣本的橫截面，噴金鍍膜后(厚度為10 nm)用Quanta250型掃描電子顯微鏡觀察其截面的超微結(jié)構(gòu)。

這些看似簡(jiǎn)單的小動(dòng)作，可以讓孕媽媽們從懷孕早期就開始鍛煉身體各個(gè)部位的力量，加快體內(nèi)新陳代謝的速度，提高骨盆關(guān)節(jié)和腰部肌肉的柔軟性，為分娩做準(zhǔn)備。韻律操每天都堅(jiān)持做才會(huì)有良好的效果。做操時(shí)動(dòng)作要輕而柔和，每次10～20分鐘，做操之前應(yīng)排盡大小便。

1.3.6細(xì)胞毒性試驗(yàn)[13]：選取較優(yōu)釋氧性能的富氧溫控型骨組織工程材料1 cm×1 cm×1 cm，無菌條件下用10 ml的Tyrode鹽緩沖液密封后浸泡10 d，用于制備材料浸提液。將8 ml的材料浸提液與0.2 ml稀釋后的抗凝兔血相混合，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，高速離心后，吸取上清液用于吸光度OD值的檢測(cè)，以檢測(cè)材料是否對(duì)血液細(xì)胞具有毒性(n=5)。為了方便對(duì)照，我們用8 ml蒸餾水和8 ml生理鹽水分別制備陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。分光光度儀測(cè)量波長(zhǎng)均為545 nm。

1.3.7生物相容性檢測(cè)：12只新西蘭白兔麻醉后，右側(cè)大腿常規(guī)備皮、消毒，切開皮膚，鈍性分離大腿部位肌肉組織后，將選取的較優(yōu)釋氧性能的富氧溫控型骨組織工程材料1 cm×1 cm×1 cm包埋于右側(cè)大腿肌肉組織內(nèi)(手術(shù)中未損傷肌纖維)。術(shù)后，各組動(dòng)物歸籠常規(guī)飼養(yǎng)，密切觀察術(shù)后傷口愈合情況。分別于術(shù)后2、4、6、8周(n=3)取植入的材料及包埋處周圍的肌肉組織，4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片后進(jìn)行HE 染色，觀察材料的生物相容性情況。

2 結(jié)果

2.1富氧溫控型骨組織工程材料的理化性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 2種濃度的富氧溫控型骨組織工程材料均可在37℃環(huán)境下，經(jīng)過4.5 min凝固成膠凍樣狀態(tài)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，2組凝固時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。2種濃度的富氧溫控型骨組織工程材料原液pH值均值為6.7左右，接近中性，2種濃度材料的pH值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.2釋氧能力檢測(cè)結(jié)果 隨著時(shí)間延長(zhǎng)，2種濃度材料浸提液中氧分壓呈上升趨勢(shì)，并在7 d達(dá)到峰值，10 d內(nèi)均可持續(xù)釋放氧氣，且10%濃度組在1～10 d的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的氧分壓明顯高于5%濃度組(P<0.01)。因此，與5%濃度組相比，1-溴十七氟辛烷濃度為10%的材料釋氧效能更高。見圖3。

圖1 不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料凝固時(shí)間比較

圖2 不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料原液pH值比較

圖3 不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料的釋氧曲線

與5%濃度1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料比較，bP<0.01

2.3掃描電鏡檢測(cè)結(jié)果 對(duì)10%濃度1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料進(jìn)行掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：材料橫斷面為無定向結(jié)構(gòu)，且較多粗細(xì)不等的纖維交織成三維立體網(wǎng)狀(圖4A)，結(jié)構(gòu)內(nèi)微孔孔徑較為均一，直徑在100～200 μm(圖4B)。

2.4細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)材料浸提液進(jìn)行稀釋后抗凝兔血混合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：材料浸提液組和生理鹽水組的混合液均為無色透明，而蒸餾水組的混合液明顯呈淡紅色，且材料浸提液組和生理鹽水組的OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而蒸餾水組的OD值高于材料浸提液組(P<0.01)。見圖5。

圖4 10%濃度1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料的超微結(jié)構(gòu)

A.材料的橫斷面為由較多粗細(xì)不等的纖維交織成的無定向網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；B.結(jié)構(gòu)內(nèi)微孔孔徑較均一，直徑100～200 μm

2.5生物相容性檢測(cè)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)中所有動(dòng)物無死亡，傷口無感染，均符合實(shí)驗(yàn)要求，并納入實(shí)驗(yàn)分析。對(duì)植入材料及周圍肌肉組織的HE染色結(jié)果顯示：術(shù)后2周，大體見：植入材料明顯縮小，局部分割被包膜包裹，未見膿液及周圍肌肉壞死組織；鏡下見：植入材料為大片均質(zhì)紅染物質(zhì)，材料周圍可見多數(shù)多核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生，材料內(nèi)見少許多核炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，周圍肌纖維萎縮，未見明顯溶解壞死。術(shù)后4周，大體見：植入材料進(jìn)一步萎縮，部分植入物血管化較明顯，觸之易出血且活動(dòng)度差；鏡下見：均質(zhì)紅染物質(zhì)內(nèi)大量肉芽組織長(zhǎng)入，多核炎癥細(xì)胞明顯減少，周圍肌纖維形態(tài)正常，未見明顯纖維化和壞死表現(xiàn)。術(shù)后6周，大體見：未見膠凍樣移植物殘留，部分個(gè)體遺留少量瘢痕組織，周圍肌肉組織稍顯腫脹；鏡下見：未見均質(zhì)紅染物質(zhì)，周圍肌纖維形態(tài)正常，可見少許多核炎癥細(xì)胞；術(shù)后8周，大體和鏡下均見正常肌肉組織。見圖6。

圖5 10%濃度1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料的細(xì)胞毒性檢測(cè)

與材料浸提液組比較，bP<0.01

圖6 10%濃度1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料的生物相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(HE)
A、B為術(shù)后2周；C、D為術(shù)后4周；E、F為術(shù)后6周；G、H為術(shù)后8周

3 討論

骨的修復(fù)過程是一個(gè)需要大量氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過程。臨床上骨缺損或骨不連的發(fā)生，大多是由于損傷局部缺氧、缺血，從而發(fā)生骨梗死等原因?qū)е碌?。有研究證實(shí)，高壓氧可以使成骨細(xì)胞表達(dá)更多的骨形態(tài)形成蛋白(BMP-2)，刺激成骨活動(dòng)，抑制破骨活動(dòng)，從而促進(jìn)骨的再生[14]。因此，在骨的修復(fù)過程中，損傷局部由始至終的充分氧供被研究者認(rèn)為至關(guān)重要。目前，臨床上應(yīng)用自體骨移植修復(fù)骨缺損是治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，而且?guī)а┑墓前暌浦裁黠@優(yōu)于游離自體骨移植的修復(fù)效果，可能是因?yàn)閹а┑墓前暌浦苍缙诰植康难豕顟B(tài)明顯優(yōu)于未血管化的游離自體骨移植。然而，由于帶血供的骨瓣移植要求特殊解剖學(xué)特點(diǎn)的局限性和自體游離骨移植的并發(fā)癥限制了其臨床應(yīng)用。因此，應(yīng)用組織工程學(xué)原理構(gòu)建各種骨移植替代材料成為目前骨缺損治療的趨勢(shì)。但是，研究者們同樣發(fā)現(xiàn)，移植局部由始至終的充分氧供同樣限制了組織工程骨的應(yīng)用。研究者普遍認(rèn)為，隨著組織工程支架的增大和移植后支架血管化較慢的原因，支架內(nèi)部的早期低氧環(huán)境無法改善，往往導(dǎo)致支架內(nèi)部種子細(xì)胞凋亡，從而使其促進(jìn)成骨的能力下降。在骨組織工程學(xué)中，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)被認(rèn)為是“黃金種子細(xì)胞”，具有明顯的促進(jìn)成骨的效能。有研究證實(shí)，在體外實(shí)驗(yàn)中，厭氧環(huán)境可以明顯阻礙MSCs向成骨細(xì)胞分化[15]；而有效的富氧環(huán)境可以有效地促進(jìn)MSCs的存活和增殖，并下調(diào)MSCs部分低氧基因的表達(dá)，阻礙其向軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，從而達(dá)到成骨效果[8]。因此，在骨組織工程支架的構(gòu)建中，改善支架內(nèi)部的低氧環(huán)境對(duì)于其成骨效能的最大化至關(guān)重要。

具有富氧特性的全氟碳化合物PFCs的出現(xiàn)為組織工程學(xué)解決早期低氧環(huán)境提供了新的解決方案。PFCs是一類具有類似結(jié)構(gòu)的高分子惰性化合物，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無毒無害、親脂、疏水，具有較好的生物相容性，在體內(nèi)雖然不降解代謝，但可被吸收入血后經(jīng)肺臟排出體外。更重要的是，該化合物具有良好的氣體溶解度，其氧氣溶解度是血液的2～3倍，作為良好的呼吸氣體運(yùn)載體，最早被廣泛應(yīng)用于人造血液、器官移植保存液等方面的研究。在骨組織工程領(lǐng)域，全氟碳化合物同樣得到了廣泛的應(yīng)用。將全氟碳化合物PFTBA與MSCs水凝膠相復(fù)合用于大鼠骨缺損的治療，PFTBA可以有效改善移植部位的低氧環(huán)境，促進(jìn)MSCs的存活和分化，促進(jìn)移植物血管化程度和骨再生[7]。進(jìn)一步的體外機(jī)制研究表明，PFTBA不僅可促進(jìn)MSCs的存活，而且可以通過調(diào)整基因表達(dá)，阻礙其向軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化[8]。在血液組織工程學(xué)、神經(jīng)組織工程學(xué)及慢性潰瘍的修復(fù)等方面，全氟碳化合物尤其是PFTBA同樣被證實(shí)可以有效改善低氧環(huán)境，促進(jìn)修復(fù)效果。然而，目前將PFTBA用于臨床的實(shí)驗(yàn)研究較少見。本實(shí)驗(yàn)中采用的1-溴十七氟辛烷同樣是一種全氟碳化合物，具有富氧劑特有的上述特性，作為第二代“人造血液”O(jiān)xygent的主要成分，已被應(yīng)用于Ⅲ期臨床試驗(yàn)[16-17]。

CS水凝膠是一種常用的組織工程材料，被廣泛應(yīng)用于皮膚、神經(jīng)、藥物緩釋系統(tǒng)等領(lǐng)域[18]。在骨組織工程領(lǐng)域，由于水凝膠本身的機(jī)械強(qiáng)度較差，水凝膠往往與其他機(jī)械強(qiáng)度較好的骨組織工程材料相復(fù)合，通過發(fā)揮其快速降解、促進(jìn)成骨、藥物緩釋等優(yōu)點(diǎn)，在骨組織工程領(lǐng)域發(fā)揮作用[19-22]。通過對(duì)CS水凝膠制備工藝的進(jìn)一步改進(jìn)，研究者們制備出了CS-β-GP-HEC溫控型水凝膠，該水凝膠在常溫狀態(tài)下呈液體狀態(tài)，一旦注入體內(nèi)37℃的環(huán)境下即可在短時(shí)間內(nèi)凝固[23-25]。將種子細(xì)胞、細(xì)胞因子和其他藥物成分與該溫控型水凝膠相復(fù)合，填充于其他機(jī)械性能較好的骨移植材料當(dāng)中，便于上述成分在修復(fù)材料中的均勻分布和緩釋效果的發(fā)揮，從而使修復(fù)效能最大化。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們將增氧劑1-溴十七氟辛烷復(fù)合入改良后的CS-β-GP-HEC水凝膠中，制備含有增氧劑1-溴十七氟辛烷的富氧溫控型骨組織工程材料。通過對(duì)不同增氧劑濃度的材料進(jìn)行凝固時(shí)間、pH值、釋氧曲線的檢測(cè)，我們認(rèn)為10%濃度的增氧劑材料具有較好的理化特征和更好的釋氧性能。掃描電鏡結(jié)果顯示：材料為無定向的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)廣泛存在的微孔結(jié)構(gòu)便于種子細(xì)胞、細(xì)胞因子和藥物成分的附著和分布，有利于組織間氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的交換和運(yùn)輸，也有利于新生血管的長(zhǎng)入。細(xì)胞毒性及生物相容性實(shí)驗(yàn)顯示，該材料無細(xì)胞毒性，生物相容性良好，在體內(nèi)可被完全降解。因此，我們認(rèn)為，將富氧劑復(fù)合入骨組織工程材料中，可以有效改善移植物早期的細(xì)胞代謝微環(huán)境，可能會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)支架內(nèi)功能性種子細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和分化，從而最大化骨組織工程材料修復(fù)骨缺損效能的發(fā)揮[26]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)篩選并制備的1-溴十七氟辛烷濃度為10%的富氧溫控型骨組織工程材料無毒無害，具有良好的理化特性、釋氧性能、生物相容性和可降解性。這種新型富氧溫控型骨組織工程材料在骨缺損治療的研究中具有良好的應(yīng)用前景。