血清microRNA-122a、microRNA-124a及microRNA-125b對膿毒癥休克并發(fā)肝損傷早期診斷及預(yù)后評估的臨床價值*

桑珍珍，高杰，賈春梅，李勇

（滄州市中心醫(yī)院 急診科，河北 滄州 061001）

膿毒癥是由感染引起機(jī)體炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。急性肝損傷可發(fā)生在膿毒癥的任何階段，膿毒癥休克時肝臟微循環(huán)處于低灌注狀態(tài)，容易出現(xiàn)肝組織和細(xì)胞的損傷、缺血和壞死[2]。有研究報(bào)道，microRNA 在調(diào)控炎癥及肝功能方面發(fā)揮重要作用，但其對膿毒癥相關(guān)肝損傷的診斷效能及預(yù)后價值尚缺乏相關(guān)研究[3-4]。本研究通過檢測膿毒癥休克患者血清microRNA-122a（miR-122a）、microRNA-124a（miR-124a） 及microRNA-125b（miR-125b）的相對表達(dá)量，分析其對膿毒癥休克合并肝損傷早期診斷及預(yù)后評估的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年12月—2019年2月滄州市中心醫(yī)院急診重癥監(jiān)護(hù)室（EICU）收治的254 例膿毒癥休克患者作為研究對象?；颊吣挲g18～80 歲，病例資料完整。根據(jù)是否發(fā)生肝損傷將患者分為肝損傷組和無肝損傷組，分別有86 和168 例。肝損傷組再按肝損傷嚴(yán)重程度分為輕、中、重度肝損傷組，分別有20、25 和41 例。肝損傷組治療28 d 后根據(jù)生存情況分為存活組和死亡組，分別有26 和60 例。選取同期本院健康體檢者40 例作為對照組?；颊呔夏摱景Y與膿毒性休克國際處理指南（2016 版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：膿毒癥為感染后序貫器官衰竭估計(jì)（SOFA）評分≥2 分；膿毒性休克指膿毒癥患者經(jīng)充分液體復(fù)蘇仍存在持續(xù)性低血壓，需要血管活性藥物維持平均動脈壓（mean arterial pressure,MAP）≥65 mmHg，血乳酸（Lac）水平＞2 mmol/L。肝損傷組患者同時符合膿毒癥相關(guān)肝損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有肝臟腫瘤、慢性肝臟疾病、梗阻性黃疸及慢性肝功能障礙急性發(fā)作入住EICU；②中毒或藥物性肝損傷等非膿毒癥原因引起的肝損傷；③年齡＜18 歲或＞80 歲；④病例資料完整性不能滿足研究要求。本研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，檢查和治療均獲得患者家屬的知情同意。

1.2 膿毒癥相關(guān)肝損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）或直接膽紅素升高至正常值上限（normal upper limit,ULN）2 倍以上；或血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）和總膽紅素（TBIL）同時升高，且其中有≥1 項(xiàng)升高至ULN 的2 倍以上。ALT 升高定義為＞80 u/L，TBIL 升高定義為＞34.1μmol/L。輕度組：1＜ALT/ALTULN＜3或1＜TBIL/TBILULN＜2；中度組：3＜ALT/ALTULN＜5 或2＜TBIL/TBILULN＜3；重度組：ALT/ALTULN＞5 或TBIL/TBILULN＞3[5]。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄患者入EICU 當(dāng)日的一般資料，包括年齡、性別、感染部位、心率（HR）、MAP、中心靜脈壓（central venous pressure,CVP）、去甲腎上腺素（NE）用量、Lac、氧合指數(shù)、血常規(guī)、生化指標(biāo)、機(jī)械通氣、急性生理學(xué)和慢性健康狀況評估Ⅱ（APACHE Ⅱ）評分及SOFA 評分等，記錄患者治療28 d 后的預(yù)后。

1.4 標(biāo)本采集與檢測

患者入院當(dāng)天（治療前）采集患者肘靜脈血5 ml，3 000 r/min 離心10 min，取血漿于-80 ℃保存，待 測miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相 對表達(dá)量。血清miRNA 提取及檢測：在miRBase 上查找目的基因序列，由美國Invitrogen 公司設(shè)計(jì)合成引物，提取血清miRNAs，合成cDNA。以U6 作為內(nèi)參，在9700 型基因擴(kuò)增儀中擴(kuò)增miRNAs。RT-PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火60 s，共40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-122a、miR-124a 及miR-125b 的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)間距 M（P25，P75）表示，比較用t檢驗(yàn)、方差分析、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或H檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線，采用二元Logistic 回歸法分析影響膿毒癥休克患者預(yù)后的危險因素，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較

肝損傷組與無肝損傷組降鈣素原（PCT）、APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分及治療28 d 后病死率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肝損傷組高于無肝損傷組。見表1。

輕、中、重度肝損傷組治療前的APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分、治療28 d 后病死率及PCT 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），重度肝損傷組高于輕、中度肝損傷組。見表2。

表1 各組臨床資料比較

續(xù)表1

表2 不同程度肝損傷組臨床資料比較

2.2 各組血清miR-122a、miR-124a、miR-125b 相對表達(dá)量比較

肝損傷組、無肝損傷組和對照組血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肝損傷組、無肝損傷組高于對照組（P＜0.05）。見表3。

各組血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），重度肝損傷組高于輕、中度肝損傷組（P＜0.05）。見表4。

血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 診斷膿毒癥休克合并肝損傷的AUC 分別為：0.796（95% CI：0.728，0.854）、0.771（95% CI：0.701，0.832）和0.784（95% CI：0.715，0.840）。當(dāng)miR-122a 表達(dá)量最佳臨界值為2.80 時，其診斷膿毒癥休克合并肝損傷的敏感性為71.76%（95% CI：67.24%，76.50%），特異性為75.29%（95% CI：71.36%，79.48%）。當(dāng)miR-124a 表達(dá)量最佳臨界值為2.56 時，其診斷膿毒癥休克合并肝損傷的敏感性為63.53%（95% CI：60.13%，67.52%），特異性為81.18%（95% CI：78.96%，85.47%）；當(dāng)miR-125b 表達(dá)量最佳臨界值為2.59 時，其診斷膿毒癥休克合并肝損傷的敏感性為72.90%（95% CI：69.58%，78.65%），特異性為78.80%（95% CI：72.66%，83.73%）。見圖1。

表3 各組血清miR-122a、miR-124a、miR-125b 相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組血清miR-122a、miR-124a、miR-125b 相對表達(dá)量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與無肝損傷組比較，P ＜0.05。

組別 n miR-122a miR-124a miR-125b對照組 40 1.03±0.02 1.12±0.25 1.09±0.26無肝損傷組 168 2.55±0.45① 2.38±0.31① 2.24±0.22①肝損傷組 86 2.83±0.56①② 2.56±0.37①② 2.59±0.44①②F 值 18.735 17.328 9.506 P 值 0.000 0.000 0.001

表4 各組入院即刻血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達(dá)量比較 （±s）

表4 各組入院即刻血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達(dá)量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與無肝損傷組比較，P ＜0.05；③與輕度肝損傷組比較，P ＜0.05；④與中度肝損傷組比較，P ＜0.05。

組別 n miR-122a miR-124a miR-125b對照組 40 1.03±0.02 1.12±0.25 1.09±0.26無肝損傷組 168 2.55±0.45① 2.38±0.31① 2.24±0.22①輕度肝損傷組 20 2.57±0.34①② 2.49±0.46①② 2.42±0.35①②中度肝損傷組 25 2.84±0.56①②③ 2.58±0.39①②③ 2.67±0.22①②③重度肝損傷組 41 3.54±0.58①②③④ 2.76±0.34①②③④ 2.85±0.42①②③④F 值 19.436 23.842 21.398 P 值 0.000 0.000 0.000

圖1 血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 診斷膿毒癥休克合并肝損傷的ROC 曲線

2.3 死亡組與存活組臨床資料比較

死亡組與存活組治療28 d 后APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分、Lac、PCT、肝損傷嚴(yán)重程度，血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），死亡組高于存活組。見 表5。

2.4 膿毒癥休克合并肝損傷預(yù)后危險因素的Logistic 回歸分析

以肝損傷嚴(yán)重程度、APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分、PCT、Lac、miR-122a、miR-124a 及miR-125b 作 為 自變量，膿毒癥休克合并肝損傷患者入院28 d 后是否死亡作為因變量（0 為否，1 為是）行二元Logistic 回歸分析。肝損傷嚴(yán)重程度、APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分和miR-122a 是影響膿毒癥休克合并肝損傷患者預(yù)后的危險因素（P＜0.05）。見表6。

表5 死亡組與存活組臨床資料比較

表6 毒癥休克合并肝損傷預(yù)后危險因素的Logistic 回歸分析參數(shù)

3 討論

膿毒癥最新定義為感染的宿主反應(yīng)失調(diào)引起的致命性器官功能障礙[1]。膿毒性休克為膿毒癥的一個亞組，具有較高的病死率，是ICU 患者主要死亡原因之一[6]。膿毒癥肝損傷的機(jī)制眾多，按發(fā)病機(jī)制不同可分為缺血缺氧性損傷、肝細(xì)胞性肝損傷和膽汁淤積性損傷[7]。膿毒癥休克引起的肝損傷主要為缺血缺氧性損傷，膿毒癥休克時肝臟微循環(huán)也處于低灌注狀態(tài)，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂，中性粒細(xì)胞浸潤，肝組織細(xì)胞缺血和壞死[8]。

有研究報(bào)道，miR-122a 能抑制抗凋亡基Bcl-xL、Bcl-2表達(dá)，導(dǎo)致大量淋巴細(xì)胞凋亡，免疫功能抑制，膿毒癥后期感染難以控制[9]。有研究報(bào)道，在急性呼吸窘迫損傷綜合征患者中，血清miR-122a 相對表達(dá)量的升高與病死率和急性肝損傷有關(guān)[10]。本研究顯示，肝損傷組血清miR-122a 相對表達(dá)量顯著高于無肝損傷組，并隨肝損傷程度加重呈遞增趨勢；死亡組患者血清miR-122a 相對表達(dá)量顯著高于存活組，表明血清miR-122a 可用于膿毒癥休克合并肝損傷的早期診斷、嚴(yán)重程度和預(yù)后評估。

有研究報(bào)道，miR-124 參與炎癥、自身免疫性及肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展[11]。有研究報(bào)道，miR-124a 通過靶向作用于白細(xì)胞介素-11，抑制肝細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，為肝癌的診斷和臨床治療提供新的靶點(diǎn)[12]。miR-124-3p 在大鼠肝撞擊損傷模型中作為Beclin1 和LC3 表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞自噬，減輕肝臟損傷[13]。miR-125 參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和缺血再灌注損傷、肝臟損傷等生理和病理過程[14-15]。在異煙肼誘導(dǎo)的肝損傷過程中，DNA 甲基化可能調(diào)控miR-125b 的表達(dá)，影響STAT-3 的表達(dá)，參與肝損傷過程[16]。在脂多糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的體外模型中，miR-125b 表達(dá)上調(diào)時可抑制TRAF6 介導(dǎo)的NF-κB激活，減弱細(xì)胞間黏附分子-1 和血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)；在膿毒癥小鼠模型中，減少心肌巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集，降低血清腫瘤壞死因子-α 和白細(xì)胞介素-1β 等炎癥因子，減輕膿毒癥引起的心功能障礙，提高生存率[17]。本研究顯示，肝損傷組血清miR-124a、miR-125b 相對表達(dá)量高于對照組，隨著miR-125b 相對表達(dá)量的升高，肝損傷程度逐漸加重，病死率逐漸升高，血清miR-125b 相對表達(dá)量對膿毒癥休克合并肝損傷的早期診斷具有臨床價值。

綜上所述，通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-122a、miR-124a 及miR-125b 對膿毒癥休克合并肝損傷有早期診斷價值，提示可作為膿毒癥休克合并肝損傷的新型生物標(biāo)志物。通過二元Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)miR-122a 是影響膿毒癥休克患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。本研究尚有許多不足之處：miRNAs 表達(dá)量的測量應(yīng)如何標(biāo)準(zhǔn)化以考慮個體或群體間的差異尚不清楚，需要在細(xì)胞、組織及動物水平作進(jìn)一步深入研究。