放射治療對肺癌患者NKG2D、HMGB1及DC細胞活性的影響*

白璐，張晶晶，高東奇，劉承一，于曉磊，李文鑫，李青山

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腫瘤科，河北 承德 067000）

放療在直接殺傷腫瘤細胞的同時能夠激活機體免疫系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境激活免疫細胞釋放免疫細胞因子，從而激活免疫功能，產(chǎn)生旁觀者效應或遠位效應[1-4]。隨著放療對免疫系統(tǒng)影響的研究不斷深入，放療作為佐劑激活免疫系統(tǒng)越來越受到重視[5]。國內(nèi)外大量研究已證實放療可以促進免疫功能，但目前確切機制尚不甚清楚。研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞及免疫細胞因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著正反雙重角色，一方面，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞因子可以招募免疫細胞進入腫瘤病灶清除腫瘤細胞；另一方面，免疫細胞因子能夠促進腫瘤細胞的生長和遠處轉移[6]。

為全面評價機體的免疫功能，該研究聯(lián)合監(jiān)測包括樹突狀細胞（dendritic cell, DC）在內(nèi)的外周血細胞因子自然殺傷組2 成員（natural killer group 2D, NKG2D）、高遷移率蛋白1（high mobility group box 1, HMGB1），探索放療對肺癌患者免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2018年1月承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科的肺癌患者進行篩查，納入經(jīng)組織病理學及影像學檢查明確為不可手術的肺癌患者30 例。納入標準：①經(jīng)病理組織學或細胞學證實的肺癌患者，年齡＜70 歲；②放療總劑量60 Gy/2 Gy/30 f，預計生存期＞3 個月；③為首次胸部放療患者，未行同期放化療及免疫調(diào)節(jié)劑治療；④卡氏體力狀況評分標準＞70分，能夠進行外周血單采的患者；⑤心、肝、腎功能正常；⑥白細胞計數(shù)（WBC）4.0×109/L ～10.0×109/L，血小板（PLT）100×109/L ～400×109/L，血紅蛋白（Hb）90 ～120 g/L。排除標準：①未經(jīng)病理學或細胞學證實的患者；②放療過程中途退出的患者；③同步放化療或放療過程中運用免疫調(diào)節(jié)劑治療的患者；④既往有胸部放療史患者。

1.2 方法

1.2.1 放療前評估 放療前對患者進行評估：①活檢病理結果；②實驗室檢查包括完善血常規(guī)、肝、腎功能及心電圖檢查；③影像學檢查包括胸部CT、腹部CT。

1.2.2 放療 所有患者采用仰臥位，雙手抱肘置于額上，采用熱塑料固定體位，CT 模擬定位，層厚5 mm，掃描范圍為下頜至肝下緣，定位CT 影像傳輸至Monaco 計劃系統(tǒng)，勾畫大體腫瘤體積、臨床靶區(qū)及計劃靶區(qū)體積。同時勾畫鄰近危及器官，包括心臟、脊髓、食管等。應用醫(yī)科達直線加速器調(diào)強放射治療（IMRT），1 次/d，200 cGy/次,每周放療5 d，放療2、4 及6 周即為放療2 000、4 000 及6 000 cGy 時，所有患者照射總劑量為6 000 cGy。

1.2.3 收集靜脈血及檢測指標 分別于放療前1 周、放療后2、4 及6 周空腹抽取患者靜脈血5 ml，置入-80℃冰箱保存。主要檢測指標：①NKG2D 及HMGB1 的動態(tài)變化；②DC 細胞存活率。

1.2.4 檢測方法 ELISA 檢測HMGB1、NKG2D（北京康泰合元生物技術有限公司）。①ELISA 特點：敏感性高、特異性強。實驗的基本原理：采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，進行定量檢測。②藥盒組份：96 孔板、96 孔板覆膜、標準品、標準品稀釋液、檢測溶液A、檢測溶液A 稀釋液、檢測溶液B、檢測溶液B 稀釋液、TMB 底物、終止液及洗滌液。③樣品采集與處理：采集血清標本，將收集到的全血標本放置室溫2 h，然后1 000 r/min 離心20 min，取上清液，將上清液放置-80℃液氮中冷凍保存，避免反復凍融。④操作步驟：加樣，設標準孔、待測樣品孔、空白孔；設標準孔，依次加入100 μl 不同濃度的標準品，空白孔加100 μl 標準品稀釋液，余孔加待測樣品100 μl；酶標板加上覆膜，37℃溫育1 h；棄去液體，甩干，不用洗滌；每孔加檢測溶液A 工作液100 μl（臨用前配制），酶標板覆膜，37℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體；每孔用350 μl洗滌液洗滌1 ～2 min，在吸水紙上輕拍酶標板來移除孔內(nèi)所有液體；重復洗板3 次；最后1 次洗滌后，吸取或倒出剩余液體孵育30 min；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次；每孔加TMB 液底物溶液90 μl，酶標板覆膜，37℃避光顯色（不要超過30 min，當標準孔的前3或4 孔有明顯的梯度藍色，后3 或4 孔梯度不明顯時，即可終止）；每孔加終止溶液終止反應，液體顏色由藍色轉為黃色；在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450 nm 波長處測量各孔的光密度（OD）值。⑤結果計算：所有OD 值都應減去空白值后再進行計算。以標準品4 000.0、2 000.0、1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 及0.0 pg/ml 為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。根據(jù)樣品OD 值在曲線圖上查出相應濃度含量，再乘以稀釋倍數(shù)10 即可。

1.2.5 免疫磁珠法檢測DC 細胞 ①從血液中純化出外周血單核細胞，磁珠標記非DC 計數(shù)，收集1×108個，1 500 r/min 離心10 min，棄上清液，加入300 μl 緩沖液重懸細胞加入100μl FcR Blocking Reagent 和100 μl Non-DC Depletion Cocktail 充分混合，2 ～8 ℃孵育15 min，加入5 ～10 ml 緩沖液洗滌細胞，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入500 μl 緩沖液重懸細胞；②磁珠分選：去除非DC 細胞，將LD 柱放置在磁力架上，用2 ml 緩沖液潤洗柱子，將細胞懸液加入柱子，收集流出液，用1 ml 緩沖液洗柱子2 次，收集流出液。流出液即為初步分離的DC 組分；③磁珠標記初步分離的DC，1 500 r/min 離心10 min 上步所得的細胞下懸液，棄上清液。用400 μl 緩沖液重懸細胞，加入100 μl DC Enrichment Cocktail。充分混合后2 ～8℃孵育15 min，加入5 ～10 ml 緩沖液洗滌細胞，1 500 r/min 離心10 min 用500 μl 緩沖液重懸細胞；④磁珠分選：篩選DC，將MS 柱放在磁力架上用2 ml 緩沖液潤洗柱子，將細胞懸液加入柱子，收集含有未標記細胞的流出液用500 μl 緩沖液洗3 次，收集含有未標記細胞的流出液，與上一步的流出液合并，將柱子放入合適的收集管中，向柱子中加入500 μl 緩沖液，立刻將活塞推入柱子，收集流出液，流出液中即為磁珠分選的DC。收集分選后的DC，收集后用臺盼藍染色，藍色代表死細胞，透明代表活細胞，用200 倍顯微鏡觀察細胞個數(shù)，活細胞數(shù)/總細胞數(shù)之比為DC 細胞存活率。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多時間點的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用Pearson 相關性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 放療前后肺癌患者血清中活DC 細胞數(shù)的變化

放療前1 周肺癌患者血清中活DC 細胞數(shù)為（155.70±62.35）個/μl，放療2、4 和6 周后分別為（185.90±92.93）、（218.17±80.03） 和（126.93±61.00）個/μl，放療前后比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.833，P=0.002）。

2.2 放療前后肺癌患者血清中HMGB1、NKG2D含量的變化

肺癌患者血清HMGB1 和NKG2D 含量放療前后比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），于放療2、4 和6 周時逐漸下降。見表1和圖1、2。

2.3 放療前后肺癌患者血清中DC 細胞存活率的變化

DC 細胞存活率比較，采用單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.839，P=0.476）。見表2 和圖3。

2.4 DC 與HMGB1、NKG2D 的相關性

DC 與HMGB1、NKG2D 無相關性（P＞0.05）。見表3。

表1 HMGB1 和NKG2D 不同時間點的變化 （n=30，±s）

表1 HMGB1 和NKG2D 不同時間點的變化 （n=30，±s）

注：?與放療前1 周比較，P ＜0.05。

指標 放療前1 周 放療2 周 放療4 周 放療6 周 F 值 P 值HMGB1 91.59±5.86 72.96±4.94? 59.66±3.16? 49.02±4.51? 480.740 0.000 NKG2D 196.57±18.67 168.71±9.68? 130.04±19.17? 78.81±9.54? 348.750 0.000

圖1 不同時段HMGB1 的含量變化 （n=30，±s）

圖2 不同時段NKG2D 的含量變化 （n=30，±s）

表2 DC 細胞存活率的變化 （n=30，±s）

表2 DC 細胞存活率的變化 （n=30，±s）

DC 細胞存活率放療前1 周 0.93±0.02放療2 周 0.94±0.02 DC 細胞存活率放療4 周 0.94±0.02放療6 周 0.93±0.03

圖3 不同時段DC 細胞存活率的變化

表3 免疫相關因子與DC 的相關性 （n=30，±s）

表3 免疫相關因子與DC 的相關性 （n=30，±s）

指標 r 值 P 值HMGB1 -0.204 0.281 NKG2D 0.105 0.580

3 討論

HMGB1 是真核細胞核內(nèi)的一種非組蛋白DNA結合蛋白，參與內(nèi)源性信號的傳遞，是細胞壞死的一種危險信號[7-8]。研究顯示，HMGB1 在胰腺癌組織中呈強陽性表達，在癌旁組織微弱表達，而在正常胰腺組織無表達，且該研究還發(fā)現(xiàn)HMGB1 的表達加速腫瘤的生長[9]。WATANABE 等[10]研究表明HMGB1 過表達后可抑制腫瘤細胞凋亡，其可能是一種抗細胞凋亡的癌蛋白。凋亡細胞釋放的HMGB1 并不是發(fā)揮促炎功能，而是能誘導機體的免疫耐受。HMGB1 是構成腫瘤微環(huán)境重要組成部分，微環(huán)境改變導致免疫抑制，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。而該實驗研究顯示，HMGB1 在放療過程呈下降趨勢，說明放射治療促進HMGB1 大量釋放的同時也在大量消耗，與YANG 等[13]研究結果相符，具體消耗機制為：①放療導致腫瘤細胞死亡釋放HMGB1，其與TLR4 結合，促進MHC-1對腫瘤抗原的加工和遞呈。②放療促進HMGB1 釋放，HMGB1 進而促進APC 活化和成熟，最終促進T 細胞活化。③HMGB1 能夠誘導DC 成熟。HMGB1 具有放射治療抵抗作用，促進腫瘤細胞生長，該研究說明常規(guī)放射治療可以降低HMGB1 的放射治療抵抗作用，從而抑制腫瘤生長。

NKG2D 于1991年首次從NKG2 的cDNA 序列進行分析時分離得到。其主要表達于活化的NK 細胞，在T 細胞、巨噬細胞、DC 也有表達，靶細胞表面NKG2D的配體與淋巴細胞表面NKG2D 的結合可以激活淋巴細胞殺傷表達NKG2D 配體的腫瘤細胞，因此，NKG2D 在腫瘤免疫中發(fā)揮了重要作用。程妮等[14]研究證實，肺癌患者與健康人群比較，患者外周血中CD8+NKT 細胞受體NKG2D 的表達下降，隨著TNM 分期的增加，NKG2D 的表達率逐漸降低。NK 細胞對放射線敏感，大量研究證實放射治療抑制NK 細胞活性[15]，該實驗檢測放療前后肺癌患者外周血中NKG2D 表達濃度，通過分析獲得常規(guī)放射治療對NKG2D 的表達為抑制作用，考慮為放療抑制NK 細胞活性，進而抑制其釋放NKG2D，與SEGOVIS 等[16]研究結果相符。

除免疫因子外，本研究還對免疫細胞進行檢測。DC 為體內(nèi)最強大的專職抗原提呈細胞，在抗腫瘤免疫中處于核心地位[17-18]，大多數(shù)腫瘤患者存在DC 數(shù)量減少及功能缺陷的特點，提示DC 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及浸潤密切相關，研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)細胞因子可影響DC 的發(fā)生及成熟[19-20]，包括IL-10、IL-12 等，本研究意在討論放療對DC 的影響，以及DC 與細胞因子HMGB1、NKG2D 的相關性，實驗結果顯示放射治療前后DC 細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義，說明放射治療對DC 細胞存活率無明顯影響。該研究還提示，通過檢測DC 細胞數(shù)和相關免疫細胞因子HMGB1、NKG2D 在放射治療前后不同時間段的表達水平，可能獲得放射治療聯(lián)合免疫治療產(chǎn)生協(xié)同效應的最佳時間區(qū)間的可靠指標。通過對DC 及相關免疫細胞因子HMGB1、NKG2D進行Pearson 相關性分析得出DC 與上述免疫細胞因子無相關，需進一步研究其原理。因免疫微環(huán)境是一個復雜多變的環(huán)境，無數(shù)的免疫細胞和細胞因子進行著復雜的信號交流活動，需要進一步探究其具體信號轉導機制。

隨著免疫治療研究的不斷深入，傳統(tǒng)治療手段與免疫治療聯(lián)合將會給腫瘤患者帶來希望。目前，放射治療聯(lián)合免疫治療新方案的實施迫切需要明確的研究方向，包括最佳放射治療劑量、放射治療過程中免疫治療加入的時間點、放射治療分割劑量及兩者聯(lián)合治療的機制。對上述問題有更多的明晰，就能更有效地以放射治療作為免疫治療的佐劑，突破腫瘤治療的難題。