VEGF siRNA 聯(lián)合涼血通絡(luò)方治療脈絡(luò)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究

王維琦 ，彭華，馬珊，楊金潤(rùn)，張昆，代自超，楊榮強(qiáng)，陳蕊，方雨葳

脈絡(luò)膜新生血管 (choroidal neovascularization，CNV)經(jīng)常發(fā)生在眼底黃斑區(qū)，是多種眼部疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性、特發(fā)性CNV、高度近視脈絡(luò)膜黃斑出血等眼底病共有的病理改變，可導(dǎo)致患者嚴(yán)重和不可逆的視力損傷[1-4]。CNV 發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，尚未闡明。目前認(rèn)為，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 是引起CNV 的重要因素之一，組織過(guò)度釋放的VEGF 參與CNV 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，因此抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子成為目前抑制CNV 的研究重點(diǎn)。通過(guò)玻璃體腔注射帶有目的基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）可高效、特異性地抑制CNV 中的VEGF 表達(dá)[5-6]。但CNV中有多因素致病、多因子參與，以抑制單一因子為目標(biāo)的治療手段，難以達(dá)到滿(mǎn)意效果。目前越來(lái)越多的研究者嘗試各種療法的有機(jī)結(jié)合，使療效得到鞏固和提高。涼血通絡(luò)方為復(fù)方光明膠囊組方加減化裁而來(lái)，具有活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)，通絡(luò)明目等多種功效，在臨床上治療CNV 類(lèi)眼病取得良好的效果[7]。本研究旨在研究涼血通絡(luò)方聯(lián)合VEGF siRNA治療CNV 類(lèi)眼病的效果并探討其作用機(jī)制，為治療CNV 類(lèi)眼病提供一種新的手段和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康8～10 周清潔級(jí)棕色BN 大鼠90 只（購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司），雌雄不限，體重180～220 g。實(shí)驗(yàn)前裂隙燈檢查雙眼前節(jié)和眼底檢查均正常。動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)適用條約符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。動(dòng)物合格證書(shū)編號(hào)為：SCXK（京）2011-0011

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器 氪激光機(jī)（美國(guó)Coherent 公司）、眼底血管造影儀（德國(guó)海德堡公司）、PCR 儀（德國(guó)Thermal）、切片機(jī)（美國(guó)Leica 公司）。

1.2.2 主要試劑 復(fù)方托吡卡胺滴眼液(北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司，4%鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥株式會(huì)社)，熒光素鈉注射液(Alcon Laboratories，Inc.美國(guó))；兔源性VEGF 多克隆抗體(Proteintech)；兔 源 性PEDF多克隆抗體(Abcam)；HRP標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體（Abmart）；RNAiso plus Total RNA 提取試劑（寶生物工程大連有限公司），Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司），HR EvaGreen qPCR Master Mix 試劑盒（上海輝睿生物科技有限公司）。

1.3 藥物

涼血通絡(luò)方由龍血竭、滇重樓、土鱉蟲(chóng)、雞血藤、密蒙花、紫草、川芎等組成，參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8]，用量與濃度按有色鼠與人用藥量比進(jìn)行換算（MechRubner 公式），配制臨床等效劑量濃度1.0 g/L生藥，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心加工成水提液，袋裝密封備用。

siRNA 由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。根據(jù)基因庫(kù)中大鼠VEGF 基因的三段mRNA 序列設(shè)計(jì)化學(xué)合成3 對(duì)VEGFsiRNA：GCGGATCAAACCTCACCAA、GCCAGCACATAGGAGAGAT、GCCTGGTATGAGGACCTGC。

1.4 方法

1.4.1 CNV 動(dòng)物模型的建立BN 大鼠，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（0.1 ml/100 g）麻醉后，右眼滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳10 min，鹽酸奧布卡因表面麻醉，應(yīng)用激光光凝儀在裂隙燈顯微鏡下，距視盤(pán)2 PD 位置圍繞視盤(pán)在2 支視網(wǎng)膜血管之間光凝1 個(gè)點(diǎn)，每眼共光凝8 個(gè)點(diǎn)。光凝參數(shù)為：波長(zhǎng)532 nm，激光功率250 mW，光凝斑直徑50 μm，光凝時(shí)間0.05 s。光凝成功的判斷：有氣泡擴(kuò)大并回縮，提示Bruch’s 膜被擊破。

1.4.2 分組90 只BN 大鼠，隨機(jī)分為3 組：空白對(duì)照組、VEGF siRNA 組、聯(lián)合治療組。各組動(dòng)物按前述方法右眼激光光凝建立CNV 模型。

1.4.3 給藥方法 空白對(duì)照組：光凝后不予任何處理；VEGF siRNA 組：從光凝后第1 d 開(kāi)始至光凝后13 d，每隔1 d 給予VEGF siRNA 5 μl（0.3 nmol/ul）玻璃體腔內(nèi)注射，方法：大鼠角鞏緣后1 mm 處垂直球心進(jìn)針,至玻腔內(nèi)可以見(jiàn)到針頭時(shí)停，推注5 μl 藥物進(jìn)入玻璃體腔內(nèi)。保持注射器針頭于玻璃體腔內(nèi)10s防止回流，緩慢拔除針頭，注射結(jié)束。聯(lián)合治療組：從光凝后第1 d 開(kāi)始至光凝后13 d，每隔1 d 給予VEGF siRNA 5 μl（0.3 nmol/ul ）玻璃體腔內(nèi)注射；同時(shí)給予涼血通絡(luò)方中藥灌胃，每只2 ml，每日1 次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 眼底熒光素血管造影（FFA）檢查 于光凝后14 d，隨機(jī)選取各組大鼠10 只，行眼底熒光素血管造影檢查，腹腔注射10%的水合氯醛（1 ml/100 g)麻醉，腹腔注射10%熒光素鈉注射液（0.1 ml/100 g），注射完成立即采用眼底照相機(jī)進(jìn)行同步動(dòng)態(tài)造影觀察照相。

1.5.2 組織病理學(xué) 光凝后14 d，各組在完成FFA 檢查后6 h，待大鼠體內(nèi)熒光素染料排凈，經(jīng)過(guò)量麻醉處死，立即摘除眼球，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，室溫過(guò)夜。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，行4 μm連續(xù)切片并常規(guī)HE 染色。取連續(xù)切片中CNV 區(qū)域內(nèi)視網(wǎng)膜至色素上皮層最大距離為CNV 中央厚度。

1.5.3 蛋白印記檢測(cè) 觀察脈絡(luò)膜VEGF、色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）蛋白表達(dá)。光凝后14 d，各組隨機(jī)選取10 只BN 大鼠，顯微鏡下去除眼前節(jié)，剝離去除視網(wǎng)膜組織，迅速置于蛋白裂解液中提取蛋白，-80℃保存。將50 μg的蛋白樣品加樣到配置好的SDS-PAGE 凝膠蛋白電泳，電泳后轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h；TBS 液漂洗；加入VEGF 抗體（1:1000）、PEDF 抗體（1:1500）、β-actin 抗體（1:5000），4℃過(guò)夜，TBS 液漂洗，HRP 標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體（1:5000）室溫孵育1 h，TBS 液漂洗，曝光顯色。應(yīng)用圖像分析軟件Image J 分析蛋白表達(dá)情況。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 觀察脈絡(luò)膜VEGF及PEDF mRNA 表達(dá)水平。光凝后14 d，各組隨機(jī)選取10 只BN 大鼠，顯微鏡下去除眼前節(jié)，將視網(wǎng)膜剝離去除，獲取脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體標(biāo)本。利用RNAiso plus Total RNA 提取試劑提取RNA，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA，采用QuantStudio 3 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，HR EvaGreen qPCR Master Mix 試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)使用。引物序列：VEGF（上游：TATCTTCAAGCCGTCCTGTG；下游：TTGACCCTTTCCCTTTCCTC）；PEDF（上游：CCGAGAACTGAAGACTATCC；下游：GTGTCCCTCAGAACAAAGA），以GAPDH 為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間的兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組熒光素滲漏面積比較

圖1 光凝后14 d 各組FFA 檢查熒光素滲漏情況。1A 空白對(duì)照組；1B VEGF siRNA 組；1C 聯(lián) 合 用藥組；1D 各組FFA熒光素滲漏面積比較條圖。* 與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；△與VEGF siRNA組比較，P＜0.05

光凝后14 d，空白對(duì)照組可見(jiàn)較大的熒光素滲漏面積，而VEGF siRNA 組及聯(lián)合組熒光素滲漏面積較小，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(VEGF siRNA 組t=2.627,P=0.014，聯(lián)合用藥組t=5.361,P=0.000)，且聯(lián)合治療組熒光素滲漏面積小于VEGF siRNA 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.733,P=0.011)（圖1）。

2.2 各組CNV 中央厚度比較

光凝后14 d，空白對(duì)照組CNV 中央厚度較厚，VEGF siRNA 組及聯(lián)合用藥組CNV 中央厚度較薄，VEGF siRNA 組與空白對(duì)照組CNV 中央厚度比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.312,P=0.013)，聯(lián)合用藥組與空白對(duì)照組CNV 中央厚度比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.147,P=0.000)，且聯(lián)合用藥組CNV 中央厚度低于VEGFsiRNA 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.372,P=0.020），與FFA 檢查趨勢(shì)一致（圖2）。

2.3 脈絡(luò)膜VEGF 蛋白及PEDF 蛋白表達(dá)變化

光凝后14 d，VEGF siRNA 組、聯(lián)合用藥組VEGF 蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(VEGF siRNA 組t=2.495,P=0.019，聯(lián)合用藥組t=5.242,P=0.000)，聯(lián)合用藥組VEGF 蛋白表達(dá)低于VEGF siRNA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.747,P=0.011)。光凝后14 d，VEGF siRNA 組PEDF 表達(dá)程度與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(t=-1.847,P=0.076)，聯(lián)合用藥組PEDF 蛋白表達(dá)程度較空白對(duì)照組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-11.11,P=0.000)（圖3A、3B）。

2.4 脈絡(luò)膜VEGFmRNA 及PEDFmRNA的表達(dá)變化

光凝后14 d，VEGF siRNA組、聯(lián)合用藥組VEGF 蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(VEGF siRNA 組t=2.795,P=0.009，聯(lián)合用藥組t=5.934,P=0.000)，聯(lián)合用藥組VEGF mRNA表達(dá)低于VEGF siRNA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.139,P=0.004)。光凝后14 d，VEGF siRNA 組PEDF mRNA表達(dá)程度與對(duì)空白照組比較無(wú)明顯差異(t=0.015,P=0.998)，聯(lián)合用藥組PEDF mRNA 表達(dá)程度較空白對(duì)照組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-17.263,P=0.000)，與蛋白印記檢測(cè)趨勢(shì)一致（圖3C）。

3 討論

VEGF 是血管新生的主要誘導(dǎo)因子,其表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂、遷移及基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解,增加血管的通透性,在CNV 發(fā)病過(guò)程中有十分重要的作用[9-10]，因此抑制VEGF 表達(dá)成為治療CNV 重要靶點(diǎn)之一[11]。

siRNA 是一種有效的基因干擾策略，siRNA 的早期干預(yù)可能通過(guò)影響VEGF 的表達(dá)而抑制CNV的生長(zhǎng)[5]。本研究采用激光光凝建立大鼠CNV 模型，于光凝后第1 d 開(kāi)始至第13 d，每隔1 d 給予VEGF siRNA 玻璃體腔內(nèi)注射，至第14 d，經(jīng)FFA 檢查及HE 染色觀察，結(jié)果顯示RNA 干擾組眼底熒光素滲漏面積及CNV 中央最大厚度均較空白對(duì)照組減小，VEGF 蛋白表達(dá)及mRNA 水平均較空白對(duì)照組降低，提示VEGF siRNA 對(duì)CNV 有明顯的抑制作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。

圖2 光凝后14 d 各組CNV 光鏡圖片(HE×200)。2A 空白對(duì)照組；2B VEGFsiRNA 組；2C 聯(lián)合用藥組；2D 光凝后14 d 各組CNV厚度比較條圖。*與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；△與VEGF siRNA 組比較，P＜0.05

圖3 各組脈絡(luò)膜VEGF、PEDF 蛋白電泳圖及表達(dá)量比較。3A 光凝后14 d 各組脈絡(luò)膜VEGF、PEDF 蛋白電泳圖，1 空白對(duì)照組；2干擾組；3 聯(lián)合用藥組；3B 光凝后14 d 各組脈絡(luò)膜VEGF、PEDF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較；3C 光凝后14 d VEGF、PEDF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較。*與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；△與VEGFsiRNA 組比較，P＜0.05

由于體內(nèi)核酸酶的存在，siRNA 在細(xì)胞內(nèi)迅速被降解，只能短暫的抑制新生血管進(jìn)程從而導(dǎo)致新生血管復(fù)發(fā)，需反復(fù)注射。隨著玻璃體腔內(nèi)注射的次數(shù)增加，可能會(huì)導(dǎo)致眼內(nèi)感染、眼壓升高、青光眼、視網(wǎng)膜脫離等諸多并發(fā)癥?；蜣D(zhuǎn)染雖然可提高抑制效果，但病毒的免疫原性和潛在突變的危險(xiǎn)性限制了其臨床應(yīng)用[13]。目前CNV 類(lèi)眼底病病機(jī)尚未十分明確，針對(duì)單分子來(lái)控制血管新生的治療手段雖然顯示出一定抑制作用，不能從根本上解決CNV 的發(fā)生及其復(fù)發(fā)問(wèn)題。而多種療法的有機(jī)結(jié)合，可協(xié)同產(chǎn)生更有效的阻止血管滲漏和抑制新生血管的形成的作用。

涼血通絡(luò)方為復(fù)方光明膠囊組方加減化裁而來(lái)，組方中含龍血竭、滇重樓、雞血藤等云南道地藥材：龍血竭性溫平，味甘咸，入心肝腎三經(jīng)，具有活血化瘀，驅(qū)腐生肌、止血斂瘡、軟堅(jiān)散結(jié)等作用，被譽(yù)為“活血圣藥”，具有雙向調(diào)控作用，為君藥；土鱉蟲(chóng)性咸寒，有小毒，入肝腎經(jīng)，具有破血逐瘀，通經(jīng)止痛功效；滇重樓性微寒，味苦，歸肝經(jīng)，清熱解毒，與土鱉蟲(chóng)共為臣藥，加強(qiáng)破血逐瘀之效；雞血藤苦甘溫，歸肝腎經(jīng)，功用補(bǔ)血，化瘀，通絡(luò)，被稱(chēng)為“血分之圣藥”；密蒙花味甘，性微寒，歸肝膽經(jīng)，清熱養(yǎng)肝，明目退翳；紫草性寒，味甘咸，歸心肝經(jīng)，功效涼血活血，與雞血藤、密蒙花共為佐藥；川芎性辛溫，歸肝膽、心包經(jīng)，功用行氣開(kāi)郁化瘀，被譽(yù)為“血中之氣藥”，為使藥。全方共奏涼血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)，退血翳通絡(luò)明目功效，在臨床上治療CNV 類(lèi)眼病取得良好的效果[7]。

本文研究結(jié)果顯示，在行玻璃體腔注射VEGF siRNA 治療的基礎(chǔ)上，再加用涼血通絡(luò)方能有效減小眼底熒光滲漏面積、CNV 厚度，能有效抑制脈絡(luò)膜新生血管生長(zhǎng)，療效高于RNA 干擾組。進(jìn)一步研究顯示，兩者聯(lián)合應(yīng)用，不僅可以降低VEGF 蛋白表達(dá)及VEGF mRNA 水平，還可增加PEDF 的蛋白表達(dá)及mRNA 水平。PEDF 屬絲氨酸蛋白酶抑制因子，是已知的最強(qiáng)的內(nèi)源性血管抑制因子，可通過(guò)促進(jìn)活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而引起新生血管的退化，抑制新生血管形成，PEDF 也可通過(guò)調(diào)節(jié)其他因子如VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor,FGF）的表達(dá)抑制血管增生[14]。

西醫(yī)治療有其不足，而中醫(yī)學(xué)博大精深，辨病與辨證相結(jié)合，內(nèi)外兼治，從絡(luò)脈理論認(rèn)識(shí)其病因病機(jī)，以絡(luò)脈“熱、瘀”立論，行涼血通絡(luò)治療，與RNA干擾技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，2 種療法的有機(jī)結(jié)合，通過(guò)多個(gè)治療靶點(diǎn)共同作用，有可能彌補(bǔ)單一療法的不足，使療效得到鞏固和提高。

綜上所述，VEGF siRNA 干擾聯(lián)合涼血通絡(luò)方應(yīng)用對(duì)于激光誘導(dǎo)的CNV 有明顯抑制作用，能更有效的阻止血管滲漏和抑制新生血管的形成的作用，為CNV 的治療提供了新思路。