桑子瑾,吳文婷,陳強,吳烈,張佳良,梁麗娜
視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion,RVO)是常見的致盲性視網(wǎng)膜血管病之一,其預(yù)后差的主要原因是易出現(xiàn)眼部新生血管及與其相關(guān)的黃斑囊樣水腫、玻璃體積血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離和新生血管性青光眼。眼部新生血管性疾病的共同病理改變是病理性新生血管形成。目前普遍認為新生血管的發(fā)生主要與缺血、缺氧有關(guān),代謝應(yīng)激(酸中毒)、力學(xué)應(yīng)激(增生的細胞產(chǎn)生的壓力)、免疫炎癥反應(yīng)等也是新生血管產(chǎn)生的因素[1]。RVO 發(fā)生后,視網(wǎng)膜血液回流發(fā)生障礙,管腔壓力增高,小血管及毛細血管破裂出血,隨后毛細血管閉塞形成無灌注區(qū),使血-視網(wǎng)膜屏障遭到破壞,視網(wǎng)膜組織缺血缺氧,發(fā)生代償反應(yīng),視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細胞增生,缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達增高,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等細胞因子持續(xù)表達,使脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮細胞不斷分裂增生,形成新生血管[2]。VEGF 是眼部新生血管生成必不可少的誘導(dǎo)因子,是當(dāng)前治療新生血管性疾病的主要作用靶點。中藥止血化瘀利水之法在RVO 所致黃斑水腫的臨床治療中取得了較為顯著的效果[3-4],理論上可以減少缺氧狀態(tài)下RPE 細胞增殖及VEGF 的分泌,有效治療新生血管性眼病。本研究通過使用化學(xué)低氧誘導(dǎo)劑CoCl2建立RPE 細胞缺氧模型,觀察止血化瘀利水方對體外培養(yǎng)的人RPE 細胞HIF-1α及VEGF 表達的影響,初步探索中藥治療RVO 黃斑水腫的作用機制。
ARPE-19 細胞(上海富衡生物科技有限公司ATCC CRL-2302TM)、DMEM/F12 培養(yǎng)液(美國Hyclone 公司)、CoCl2(美國Sigma 公司)、CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)、人VEGF ELISA 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,EK0539)、超純RNA 提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,CW0581)、HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,CW0744)、SYBR Green PCR Mixture 試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,CW0957)、復(fù)方血栓通膠囊(廣東眾生藥業(yè)股份有限公司,批號170206)、止血化瘀利水方(由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥劑科提供,組成:桃仁、生蒲黃、當(dāng)歸、赤芍、生地黃、小薊、茯苓皮、澤瀉、側(cè)柏葉、茜草炭、枳殼、柴胡)。
1.2.1 含藥兔血清的制備 新西蘭兔14 只,兔齡10~12 個月,體重2.3~2.5 kg,雌雄各半,隨機分為3組:中藥組5 只、陽性對照組5 只、空白對照組4 只。中藥組:將止血化瘀利水方中藥飲片每劑以2000 ml水煎制成200 ml 濃縮液,灌胃劑量相當(dāng)于臨床劑量2 倍,參考《藥理實驗方法學(xué)》折算[5]。每日給予止血化瘀利水方湯藥灌胃1 次(每日9 時),給藥劑量為5 ml/kg·d。陽性對照組:每日給予復(fù)方血栓通膠囊內(nèi)容物灌胃1 次(每日9 時),給藥劑量為0.245 g/kg·d。空白對照組:每日相同時間給予等劑量的蒸餾水。各組連續(xù)灌胃7 d 后全麻下腹主動脈采血制備無菌含藥血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 ARPE-19 細胞的培養(yǎng) 購置凍存AREP-19細胞株,換含15%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,次日按1:2 傳代。細胞密度達90%時棄培養(yǎng)液,PBS 洗2 遍,加入0.25%的胰酶1 ml 消化3 min,鏡下見細胞變圓,加入15%DMEM/F12 終止消化,吸管反復(fù)吹打,形成細胞懸液,一分為二接種于新的培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱,2~3 d 換液1 次。
1.2.3 CoCl2誘導(dǎo)RPE 細胞缺氧模型的建立 細胞接種于96 孔板中,每孔100 μl,培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)液,加入不含胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)24 h。分為正常組和不同濃度CoCl2組(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L),每組設(shè)5 個復(fù)孔,每孔100 μl。37℃5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24 h、48 h、72 h,每孔加入20 μl CCK-8,繼續(xù)孵育4 h 后置于酶標(biāo)儀上測450 nm 吸光度值。
細胞接種于96 孔板中,每孔100 μl,培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液,加入不含胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)24 h。將ARPE-19 細胞分為正常組、缺氧模型組、含藥血清干預(yù)組(分別予濃度為5%、10%、20%的止血化瘀利水方含藥血清、復(fù)方血栓通含藥血清、空白血清),每組設(shè)5 個復(fù)孔,每孔100 μl。37℃5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24 h、48 h、72 h,每孔加入20 μl CCK-8,繼續(xù)孵育4 h 后置于酶標(biāo)儀上測450 nm 吸光度值。
細胞接種于24 孔板中,每孔1 ml,分為中藥組、陽性對照組、空白對照組、缺氧模型組、正常組。中藥組:加入CoCl2200 μmol/L 和止血化瘀利水方含藥血清;陽性對照組:加入CoCl2200 μmol/L 和復(fù)方血栓通含藥血清;空白對照組:加入CoCl2200 μmol/L和空白血清;缺氧模型組:加入含CoCl2200 μmol/L的DMEM;正常組:加入不含F(xiàn)BS 的DMEM。細胞懸液中加入血清或培養(yǎng)液后分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,收集培養(yǎng)上清。按照人VEGF ELISA 檢測試劑盒說明進行操作。酶標(biāo)儀上測450 nm 吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)VEGF 濃度。
采用熒光定量PCR(real-time PCR)方法,Primer Premier5.0 軟件設(shè)計引物,由上海生工全程合成。按照上述分組處理細胞,收集細胞,使用超純RNA 提取試劑盒,按其說明書步驟操作提取RNA。使用HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。以cDNA 為模板進行PCR 擴增,采用UltraSYBR Mixture 試劑盒建立擴增反應(yīng)體系,將樣品cDNA 各取1μl 做模板,分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。
采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,對資料進行單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗和SNK 檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
5 個不同濃度CoCl2分別培養(yǎng)ARPE-19 細胞24h、48 h、72 h。25 μmol/L 和50 μmol/LCoCl2組與正常組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而100 μmol/L和200 μmol/L CoCl2組吸光度值均升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(100 μmol/L 組:t24h=-2.158,P24h=0.037;t48h=-2.381,P48h=0.016;t72h=-4.108,P72h=0.004;200 μmol/L 組:t24h=-2.974,P24h=0.012;t48h=-4.247,P48h=0.001;t72h=-2.882,P72h=0.004);400 μmol/L CoCl2組吸光度值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。100 μmol/L、200 μmol/L濃度組間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。200 μmol/L CoCl2組在24 h、48 h、72 h 吸光度值均最大,設(shè)立為缺氧細胞造模濃度(表1)。
表1 不同濃度CoCl2 對各時點ARPE-19 細胞增殖活性的影響(±s,n=5)
表1 不同濃度CoCl2 對各時點ARPE-19 細胞增殖活性的影響(±s,n=5)
注:* 與正常組同時間段比較,P<0.05
不同濃度含藥血清(5%、10%、20%)作用于缺氧化ARPE-19 細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。與缺氧模型組比較,5%止血化瘀利水方含藥血清組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),10%和20%濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(10%組:t24h=2.944,P24h=0.002;t48h=2.044,P48h=0.023;t72h=2.530,P72h=0.030;20%組:t24h=4.305,P24h=0.001;t48h=2.588,P48h=0.003;t72h=3.517,P72h=0.018),而兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);5%復(fù)方血栓通含藥血清組在24 h 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.786,P=0.013),在48 h、72 h 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),10%和20%濃度組在24 h、48 h 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(10%組:t24h=12.980,P24h<0.001;t48h=3.787,P48h=0.003;20%組:t24h=11.680,P24h<0.001;t48h=4.837,P48h=0.001),在72 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),10%和20%兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);各濃度空白血清組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。綜合比較,20%濃度血清各組對缺氧模型細胞增殖活性影響最大,故選用于后續(xù)試驗。結(jié)果提示止血化瘀利水方含藥血清、復(fù)方血栓通含藥血清對ARPE-19 細胞增殖均有抑制作用,前者的作用相對持久。
ELISA 結(jié)果顯示在24 h、48 h、72 h 3 個時間點,各組內(nèi)VEGF 蛋白濃度均隨時間推移呈遞增趨勢(表2)。與正常組比較,缺氧模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t24h=-9.794,P24h<0.001;t48h=-7.447,P48h<0.001;t72h=-10.466,P72h<0.001)。與缺氧模型組比較,空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);陽性對照組、中藥組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(陽性對照組:t24h=2.897,P24h=0.001;t48h=2.308,P48h=0.013;t72h=4.748,P72h<0.001;中藥組:t24h=4.242,P24h<0.001;t48h=3.430,P48h<0.001;t72h=2.501,P72h=0.006)。在48 h、72 h 陽性對照組與中藥組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t48h=2.429,P48h=0.024;t72h=-1.933,P72h=0.036)。
HIF-1αmRNA:與正常組比較,缺氧模型組在24 h、48 h、72 h 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t24h=-2.658,P24h=0.034;t48h=-6.150,P48h<0.001;t72h=-3.203,P72h=0.006)。與缺氧模型組比較,空白對照組、陽性對照組、中藥組在24 h、72 h 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),在48 h,3 種血清對HIF-1α mRNA 表達均起到明顯抑制作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t空白=16.822,P空白<0.001;t陽性=14.918,P陽性<0.001;t中藥=15.358,P中藥<0.001),3 種血清間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。
VEGF mRNA:與正常組比較,缺氧模型組在24 h、48 h、72 h 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t24h=-4.946,P24h<0.001;t48h=-12.863,P48h<0.001;t72h=-5.561,P72h=0.011)。與缺氧模型組比較,24 h、72 h 空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),陽性對照組與中藥組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(陽性對照組:t24h=3.437,P24h=0.001;t72h=-2.219,P72h=0.031;中藥組:t24h=3.084,P24h=0.003;t72h=-6.115,P72h=0.009),但兩組間比較差異,無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);48 h,空白對照組、陽性對照組、中藥組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t空白=4.676,P空白<0.001;t陽性=13.554,P陽性<0.001;t中藥=14.837,P中藥<0.001),但陽性對照組和中藥組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。
表2 ELISA 法測各組細胞吸光度值、VEGF 蛋白濃度(±s,n=5)
表2 ELISA 法測各組細胞吸光度值、VEGF 蛋白濃度(±s,n=5)
注:* 與缺氧模型組比較,P<0.05;△陽性對照組與中藥組比較,P<0.05
表3 RT-PCR 測各組細胞相關(guān)因子mRNA 表達(±s,n=3)
表3 RT-PCR 測各組細胞相關(guān)因子mRNA 表達(±s,n=3)
注:* 與同指標(biāo)同時間缺氧模型組比較,P<0.05
RVO 發(fā)生后視網(wǎng)膜缺血缺氧,脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)相關(guān)并發(fā)癥出現(xiàn),如黃斑水腫、玻璃體積血等,嚴(yán)重影響患者視功能。CNV 的形成是一個多因素共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程,缺氧是目前較為明確的原因,可以導(dǎo)致RPE 細胞內(nèi)信號通路和細胞因子的表達變化。RPE 細胞位于視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和脈絡(luò)膜之間,與視網(wǎng)膜光感受器細胞層、Bruch 膜及脈絡(luò)膜毛細血管構(gòu)成光感受器細胞-RPE-Bruch 膜-脈絡(luò)膜毛細血管復(fù)合體,其與眼底新生血管性疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系[6]。正常情況下,RPE 細胞以HIF-1α 非依賴途徑分泌VEGF,通過RPE 與脈絡(luò)膜新生血管之間的旁分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在脈絡(luò)膜穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用;在缺氧狀態(tài)下,RPE 細胞增殖、遷移,并通過HIF-1α 上調(diào)VEGF 的表達[7],Bruch 膜損傷,視網(wǎng)膜的穩(wěn)態(tài)及完整性無法維持,最終形成脈絡(luò)膜新生血管,視網(wǎng)膜光感受器細胞因缺乏脈絡(luò)膜營養(yǎng)供應(yīng)而凋亡[8]。
中醫(yī)眼科學(xué)認為,RVO 合并黃斑水腫等新生血管相關(guān)并發(fā)癥屬于“絡(luò)瘀暴盲”范疇,乃“久病入絡(luò)”“敗絡(luò)叢生”之變證、惡證,“瘀”是其最主要的病理因素。根據(jù)《血證論》“瘀血化水,亦發(fā)水腫,是血病而兼水也”及《金匱要略·水氣病脈證并治》“經(jīng)為血,血不利則為水,名曰血分”等的病因病機論述,本研究認為針對RVO 合并黃斑水腫等新生血管相關(guān)性并發(fā)癥仍然應(yīng)從“血證論治”為主,宜“絡(luò)病論治”“理血治水”故治以止血化瘀為主,兼利水消腫,這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用玻璃體腔注射抗VEGF 制劑的思路有相似之處。課題組前期研究證實,十灰散可以調(diào)節(jié)RVO 凝血機制,有利于減少視網(wǎng)膜出血、水腫;血府逐瘀湯有助于調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微循環(huán)狀態(tài),從而改善缺血缺氧環(huán)境,抑制VEGF 生成和表達,減少CNV 并發(fā)癥[9]。止血化瘀利水方是十灰散、血府逐瘀湯及五苓散化裁而成,方中以桃仁活血化瘀、生蒲黃涼血止血,共為君藥;當(dāng)歸、赤芍助桃仁化瘀,生地黃、小薊助生蒲黃涼血止血,當(dāng)歸、赤芍、生地黃并能滋陰養(yǎng)血補虛,茯苓皮運脾利水、澤瀉泄熱利濕,共為臣藥;側(cè)柏葉涼血止血、茜草炭涼血祛瘀,為佐助藥;枳殼、柴胡行氣以推動血行,為使藥。諸藥合用,共奏涼血止血、化瘀利水之功效。
本實驗選用復(fù)方血栓通膠囊作為陽性對照藥。有研究表明,復(fù)方血栓通成分可使糖尿病小鼠視網(wǎng)膜VEGF 表達降低[10];補氣活血中藥干預(yù)可抑制VEGF的表達,達到減少和延緩視網(wǎng)膜新生血管的形成和發(fā)展的目的[11];活血化瘀藥物三七和丹參能減少血管增生性視網(wǎng)膜病變小鼠的VEGF 含量,可通過改善局部缺氧環(huán)境或影響各種新生血管生長因子而阻止視網(wǎng)膜新生血管形成[12]。結(jié)果表明,止血化瘀利水方和復(fù)方血栓通含藥血清均能夠抑制缺氧化ARPE-19 細胞的增殖,降低細胞中VEGF 蛋白含量,下調(diào)VEGF 和HIF-1α mRNA 表達,因此推測改善缺氧環(huán)境及抑制VEGF 是中藥發(fā)揮作用的關(guān)鍵機制之一。止血化瘀利水方對ARPE-19 細胞增殖的抑制作用比復(fù)方血栓通更持久,前者在24 h、48 h 控制VEGF 蛋白表達水平更接近正常組,作用略強于后者;而二者在抑制VEGF 和HIF-1α mRNA 表達方面作用接近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。細胞模型到72 h時可能出現(xiàn)VEGF mRNA 表達自行下調(diào)。
本實驗為中醫(yī)臨床“絡(luò)病論治”“理血治水”治療RVO 合并黃斑水腫等新生血管相關(guān)性并發(fā)癥提供了初步的理論依據(jù),為不同中醫(yī)證型提供了更多的組方選擇。止血化瘀利水方可用于治療RVO 證屬陰虛血熱兼有血瘀水停者,復(fù)方血栓通膠囊則適用于治療RVO 證屬血瘀兼氣陰兩虛患者。