兩種實(shí)驗(yàn)室技術(shù)對(duì)肺結(jié)核患者手術(shù)后不同組織標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果分析

宮亞婭 魯懷偉 王琦 操樂(lè)杰

結(jié)核病的準(zhǔn)確診斷是有效治療的關(guān)鍵因素，目前主要的診斷方法包括痰涂片抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及分子生物學(xué)檢測(cè)等[1]。對(duì)于無(wú)痰患者，無(wú)法進(jìn)行痰涂片抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。因此，可以考慮獲取組織學(xué)證據(jù)排除其他診斷，最終確診肺結(jié)核的存在。2010年12月，WHO的報(bào)告推薦使用GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷[2]。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]也明確了病理學(xué)和分子生物學(xué)檢查在肺結(jié)核診斷中的地位。本研究以安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院疑診的肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，評(píng)估抗酸染色和GeneXpert檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核手術(shù)標(biāo)本的診斷價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

1. 研究對(duì)象的選擇：收集2017年6月至2019年1月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，門診診斷為疑診肺結(jié)核，肺癌不能排除，行肺部手術(shù)治療的63例患者。排除病理標(biāo)本不合適的3例患者，最終納入60例患者作為研究對(duì)象。其中，男42例，女18例；年齡21～80歲，平均年齡(48.0±13.4)歲。病理標(biāo)本中，表現(xiàn)為干酪樣壞死性肉芽腫的標(biāo)本16例，表現(xiàn)為肉芽腫不伴有干酪樣壞死的標(biāo)本44例。

2. 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]，影像學(xué)(CT檢查)提示結(jié)節(jié)病灶或空洞；考慮疑診肺結(jié)核，肺癌不能排除。(2)因患者病灶位置及大小等原因，無(wú)法行支氣管鏡下穿刺或肺穿刺等活檢-病理檢查，因而行肺部手術(shù)獲得病理組織，術(shù)后病理提示為肉芽腫性疾病，考慮為肺結(jié)核可能；依據(jù)《中國(guó)結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識(shí)》[4]，病理組織鏡下表現(xiàn)具有滲出性、壞死性、增生性3種基本病理變化中至少一種病變類型。

3. 排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不全，送檢標(biāo)本因過(guò)小、破碎、固定不當(dāng)、自溶、嚴(yán)重變形等，無(wú)法做出診斷者。

二、研究方法

(一)儀器與試劑

光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)CX31)、萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)試劑盒[賽沛(上海)商貿(mào)有限公司]、晶芯?芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法；博奧晶典生物技術(shù)有限公司)。

(二)檢測(cè)方法

1. 抗酸染色法：將肺手術(shù)標(biāo)本置于10%中性福爾馬林溶液中充分固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為3～4 μm，65 ℃烤片2 h，脫蠟2次，每次5～10 min，切片脫蠟后，待余液揮發(fā)干，用流水沖洗至無(wú)肉眼可見油狀物附著，使用Z-N方法染色。常規(guī)脫水和安裝后，由2位病理學(xué)家在油鏡下檢查處理過(guò)的樣本。具體操作參見《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]。

2. GeneXpert檢測(cè)：在一支干凈的離心管中加入8片10 μm厚手術(shù)肺組織石蠟包埋切片，加入320 μl脫蠟溶液，于56 ℃孵育3 min，加入180 μl ATL緩沖液，旋渦振蕩，11 000×g離心1 min，加入20 μl蛋白酶K至下部澄清的液相層中，于56 ℃孵育至少1 h直至組織切片完全消化，再于90 ℃孵育1 h。將下部無(wú)色透明的液相及底部沉淀一同吸出至一個(gè)新的螺蓋離心管中(>2 ml)，向其中加入2 ml樣本處理液，渦旋振蕩混勻后，加入試劑匣。GeneXpert檢測(cè)結(jié)果在2 h內(nèi)自動(dòng)生成并報(bào)告為未檢測(cè)到MTB或檢測(cè)到MTB，半定量化為極少量、少量、中量、大量；同時(shí)報(bào)告利福平敏感或耐藥。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照GeneXpert檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書使用。

3. 分枝桿菌菌種鑒定：采用晶芯?芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。將手術(shù)肺組織石蠟包埋切片標(biāo)本置于無(wú)菌密封瓶，將標(biāo)本分為2份，1份用于檢測(cè)，另1份用于兩種檢測(cè)有差異時(shí)的復(fù)查備用或進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)；向滅活后的標(biāo)本中加入等體積10%的NaOH溶液，于37 ℃液化30 min；取1 ml上述液化標(biāo)本，以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心5 min，去除上清液；向離心管中加入1 ml生理鹽水，渦旋后再次以離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心5 min，去上清液備用。將上清液進(jìn)行核酸提取、PCR擴(kuò)增，將雜交溶液加入芯片，置于雜交儀，50 ℃雜交2 h后于雜交儀中洗滌，將完成洗滌、甩干的芯片插入LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀插槽中，運(yùn)行相應(yīng)的分枝桿菌菌種鑒定程序，對(duì)芯片進(jìn)行掃描及判讀。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照分枝桿菌菌種鑒定試劑盒說(shuō)明書使用。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以“率(%)”表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

60例疑診肺結(jié)核患者的手術(shù)病理標(biāo)本中，抗酸染色檢出陽(yáng)性29例，GeneXpert檢出陽(yáng)性28例?？顾崛旧?、GeneXpert的陽(yáng)性檢出率分別為48.3%(29/60)和46.7%(28/60)。其中，4例GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性，抗酸染色結(jié)果為陰性；5例GeneXpert檢測(cè)陰性，抗酸染色結(jié)果為陽(yáng)性。若以任意一種方法檢測(cè)陽(yáng)性作為聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率為55.0%(33/60)，較抗酸染色的陽(yáng)性檢出率提高 6.7%，較GeneXpert的陽(yáng)性檢出率提高8.3%。

在60例疑診肺結(jié)核患者中，GeneXpert檢測(cè)在干酪樣和非干酪樣壞死標(biāo)本中的陽(yáng)性檢出率分別為81.2%(13/16)和34.1%(15/44)；抗酸染色在干酪樣和非干酪樣壞死標(biāo)本中的陽(yáng)性檢出率分別為87.5%(14/16)和34.1%(15/44)。GeneXpert檢測(cè)和抗酸染色檢測(cè)干酪樣壞死標(biāo)本的檢出率均明顯高于非干酪樣壞死標(biāo)本，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.48，P=0.001；χ2=13.40，P<0.001)。

60例標(biāo)本中，5例標(biāo)本抗酸染色陽(yáng)性，GeneXpert檢測(cè)為陰性；為排除非結(jié)核分枝桿菌感染的可能，此5例標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，結(jié)果顯示5例均為結(jié)核分枝桿菌，提示GeneXpert檢測(cè)存在假陰性的可能。在GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性的28例標(biāo)本中，有3例(10.7%)被報(bào)告為對(duì)利福平耐藥。

討 論

由于結(jié)核分枝桿菌病原菌的基因變異，糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，抗生素的不規(guī)范使用等原因，越來(lái)越多肺結(jié)核患者的癥狀、體征變得不典型，當(dāng)影像學(xué)表現(xiàn)為結(jié)節(jié)或腫塊時(shí)，容易與肺癌或結(jié)節(jié)病相混淆[6]。病理檢查為診斷結(jié)核病的方法之一，不同結(jié)核病患者的病理標(biāo)本可以見到滲出、增生、變性壞死等不同類型的結(jié)核病病理表現(xiàn)，不同病理類型反映了患者機(jī)體的不同免疫狀態(tài)[7]。同時(shí)，能引起與結(jié)核病相似的肉芽腫性炎和壞死的病因很多，包括非結(jié)核分枝桿菌感染、曲霉菌病、隱球菌病、異物肉芽腫等，需要與結(jié)核病鑒別[8]。由于抗酸染色易受非結(jié)核分枝桿菌的干擾，因此不能僅憑抗酸染色陽(yáng)性就確診結(jié)核病，而只能提示可能存在結(jié)核病[5]。而新近發(fā)展的分子檢測(cè)方法針對(duì)結(jié)核分枝桿菌核酸進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行明確診斷。

GeneXpert檢測(cè)為一種全自動(dòng)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定法，由工作人員進(jìn)行較少的培訓(xùn)即可完成，可以在2 h內(nèi)提供結(jié)果，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)便、核酸污染低、操作人員安全等優(yōu)點(diǎn)[9]。對(duì)肺結(jié)核的診斷有很高的特異度，并且已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷[10-11]。Rindi等[12]評(píng)估了石蠟包埋的組織標(biāo)本行GeneXpert檢測(cè)的可行性，研究共收集了14份標(biāo)本，3份來(lái)自胸膜，1份來(lái)自鎖骨上淋巴結(jié)，10份來(lái)自肺組織，在所有14份抗酸染色陽(yáng)性標(biāo)本中GeneXpert檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。但本研究有5份標(biāo)本抗酸染色結(jié)果為陽(yáng)性，GeneXpert檢測(cè)為陰性，且隨后進(jìn)行的分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果均為結(jié)核分枝桿菌，原因可能在于石蠟組織經(jīng)固定、脫水、透明等前期處理時(shí)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA產(chǎn)生了影響，特別是對(duì)于含菌量極少的組織，長(zhǎng)期儲(chǔ)存可能導(dǎo)致DNA降解(本研究收集的標(biāo)本時(shí)間為2年內(nèi))，使其GeneXpert檢測(cè)結(jié)果顯示為陰性[13]。此外，當(dāng)患者肺組織標(biāo)本中含菌量極少時(shí)，抗酸染色切片和GeneXpert檢測(cè)切片不在同一切面上，有可能存在GeneXpert切片組織內(nèi)不含菌的情況。因此，獲得合適的肺組織病理切片，并立即進(jìn)行檢測(cè)可提高GeneXpert的陽(yáng)性檢出率?？顾崛旧蚓邆浜?jiǎn)便、花費(fèi)少的特點(diǎn)，可在患者初篩時(shí)使用，但是由于其無(wú)法鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，僅能做出提示性診斷，無(wú)法最終確診，為獲得明確診斷結(jié)果，仍需依賴GeneXpert檢測(cè)，必要時(shí)可采取兩種方法聯(lián)合檢測(cè)。本研究結(jié)果顯示，GeneXpert與抗酸染色方法聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率為55.0%，達(dá)到“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃要求的到2020年病原學(xué)檢出率提高至50%的目標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，4例患者GeneXpert檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，抗酸染色未能檢出，提示如果患者臨床表現(xiàn)符合肺結(jié)核特征，抗酸染色陰性不能完全排除結(jié)核病。同時(shí)，GeneXpert檢測(cè)可以利用實(shí)時(shí)熒光定量核酸檢測(cè)技術(shù)，在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的同時(shí)檢測(cè)是否對(duì)利福平耐藥，且GeneXpert檢測(cè)與藥物敏感性試驗(yàn)在檢測(cè)利福平耐藥性上具有高度一致性，可為后續(xù)治療提供依據(jù)[14]。本研究中，檢測(cè)出利福平耐藥的比率為10.7%，說(shuō)明在明確診斷肺結(jié)核的患者中存在一定比例的耐利福平患者，如果能夠同時(shí)將耐藥結(jié)果檢測(cè)出來(lái)，對(duì)于規(guī)范結(jié)核病的診斷、及時(shí)合理治療耐藥結(jié)核病具有重要意義。

本研究存在很多不足之處：首先，研究樣本量偏??；其次，本研究?jī)H對(duì)抗酸染色陽(yáng)性、GeneXpert檢測(cè)陰性的標(biāo)本進(jìn)行了菌種鑒定，未對(duì)全部患者標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定；再者，本研究未納入非結(jié)核病患者，無(wú)法進(jìn)行特異度及其他檢測(cè)效能的比較。未來(lái)還需要收集更多的病理標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。