超聲-微波法合成亞油酸β-谷甾醇酯

袁傳勛，張雪茹，徐 云，郭玉華，金日生

（合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

植物甾醇廣泛存在于植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中[1]，是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的甾體類化合物[2]，有降低血脂[3]和膽固醇[4]、抗癌[5-6]、抗氧化[7]、免疫[8-9]、抗 炎[10]、抗?jié)僛11]等生理功能，被譽(yù)為“生命的鑰匙”[12]。

收稿日期：2018-12-27

基金項(xiàng)目：安徽省科技重大專項(xiàng)（16030701085）；安徽大學(xué)現(xiàn)代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項(xiàng)目（BM2016005）

第一作者簡(jiǎn)介：袁傳勛（1964ü ）（ORCID: 0000-0003-2464-1411），男，研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail: ycx608@sohu.com

*通信作者簡(jiǎn)介：金日生（1982ü ）（ORCID: 0000-0002-2140-6507），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail: jinrisheng@hfut.edu.cn

β-谷甾醇屬于植物甾醇的一種，具有很好的生理活性和安全性，不僅可以降低人體對(duì)飲食中膽固醇的吸收，還可以降低人體血漿中總膽固醇和低密度脂蛋白的含量[13]。張帆[14]研究了植物甾醇對(duì)Caco-2細(xì)胞中膽固醇吸收的構(gòu)效關(guān)系，研究表明這6 種植物甾醇均能濃度依賴性地降低膽固醇吸收，且作用效果為β-谷甾醇＞豆 甾醇＞菜油甾醇＞星魚甾醇。近年來，以β-谷甾醇為代表的植物甾醇類越來越多地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等[15]行業(yè)。然而，植物甾醇類化合物微溶于油，不溶于水的特點(diǎn)限制了它的應(yīng)用。將植物甾醇與脂肪酸進(jìn)行酯化反應(yīng)合成的植物甾醇酯具備植物甾醇所有的優(yōu)良性能，且合成的甾醇酯對(duì)抑制人體膽固醇吸收的作用優(yōu)于植物甾醇[16]，另外也有研究指出植物甾醇酯能減輕非酒精性脂肪肝大鼠高脂飲食引起的肝脂肪變性[17]。與植物甾醇相比，其在油中具有更高的溶解度以及更低的熔點(diǎn)[18]。目前，為了進(jìn)一步擴(kuò)大植物甾醇的應(yīng)用領(lǐng)域，將植物甾醇合成植物甾醇酯逐漸成為研究中的熱點(diǎn)。

王永高[19]指出超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)有利于空化核的產(chǎn)生，可以加速酯交換反應(yīng)進(jìn)程，吳梅等[20]指出超聲波和微波聯(lián)用可以強(qiáng)化傳質(zhì)傳熱過程，能顯著縮短酯化反應(yīng)時(shí)間。本研究利用超聲波輔助微波法合成亞油酸β-谷甾醇酯，合理利用超聲波的強(qiáng)穿透力、機(jī)械攪拌作用以及空化效應(yīng)[21-22]，在已有微波酯化工 藝上[23-24]進(jìn)行改善，與已有方法相比[25-27]，合成工藝更加簡(jiǎn)單，大大縮短了酯化反應(yīng)時(shí)間，酯化率高且合成過程中不使用額外催化劑和吸水劑，為后續(xù)分離純化工藝節(jié)工省時(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-谷甾醇（純度為95%） 西安全奧生物科技有限 公司；亞油酸（純度為95%） 山東西亞化學(xué)股份有限公司；β-谷甾醇標(biāo)品（純度≥98%） 上海廣銳生物科技有限公司；亞油酸β-谷甾醇酯高純品由合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心制備，純度≥99.5%；氘代氯仿（純度≥99.99%） 北京邁瑞達(dá)科技有限 公司；正己烷、無水乙醇、碳酸氫鉀、溴化鉀均為分析純；甲醇（色級(jí)） 德國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-1B恒速電動(dòng)攪拌器、JP-020超聲波清洗機(jī)、EG720KG3-NR1微波爐 廣東美的廚房電器制造有限公司；DZF-6050真空烘箱 上海和呈儀器制造有限公司；E2695高效液相色（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Waters 公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀 美國(guó)Thermo Nicolet儀器 公司；Vario EL Cube元分析儀 德國(guó)Elementar公司；VNMRS600超導(dǎo)核磁共振波（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）儀 美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 方法

固定條件為酸醇物質(zhì)的量比2∶1，每次加熱4 min，微波加熱3 次，每?jī)纱渭訜嶂g品置于超聲儀（120 W，80 ℃）中超聲60 s。固定其他因水平，分別考察酸醇物質(zhì)的量比（0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1）、每次微波加熱時(shí)間（1、2、3、4、5、6 min）、微波加熱次數(shù)（1、2、3、4、5、6 次）、每?jī)纱渭訜嶂g品置于超聲儀（120 W，80 ℃）中超聲時(shí)間（0、30、60、90、120、150 s）對(duì)酯化率的影響。

1.3.2 正交試驗(yàn)

表 1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Level of independent variables used for L9(34) orthogonal array design

1.3.3 最佳工藝條件驗(yàn)證

以正交試驗(yàn)所確定的最佳合成工藝條件對(duì)亞油酸和β-谷甾醇進(jìn)行酯化反應(yīng)合成亞油酸β-谷甾醇酯，驗(yàn)證比較酯化率的大小。

1.3.4 亞油酸β-谷甾醇酯的純化

取正己烷80 mL，無水乙醇120 mL混勻，置于50 ℃水浴鍋中加熱至恒溫，加入0.3 mol/L的KHCO3溶液至pH 7～8，溶解所制得的亞油酸β-谷甾醇酯粗品，并移入分液漏斗中靜置分層，取上層清液，再重復(fù)萃取 一次[28]。將第2次萃取的上層清液于真空烘箱中烘干，得到純化后的亞油酸β-谷甾醇酯，下一步對(duì)得到的亞油酸 β-谷甾醇酯進(jìn)行分析鑒定，亞油酸與β-谷甾醇酯化反應(yīng)方程式見圖1。

圖 1 酯化反應(yīng)方程式Fig. 1 Esterification reaction equation

1.3.5 反應(yīng)產(chǎn)物的定性分析

1.3.5.1 HPLC分析檢測(cè)條件[28]：色柱：C18反相色柱（4.6 mmh 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：丙酮-乙腈（3∶1，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)量：10 μL。

1.3.5.2 FTIR分析

F TI R儀以衰減全反射技術(shù)（attenuate d tota l reflectance，ATR）測(cè)試β-谷甾醇以及亞油酸β-谷甾醇酯的特征結(jié)構(gòu)。測(cè)試范圍：4 000～525 cm1，分辨率為4 cm1；掃描次數(shù)為32 次；檢測(cè)配件：ATR。

1.3.5.4 超導(dǎo)NMR分析

1.3.7 油溶性

取4 份50 mL的茶籽油水浴加熱至80 ℃，邊攪拌邊加入亞油酸β-谷甾醇酯至飽和，然后分別置于5、4、25、40 ℃條件12 h，然后取茶籽油皂化洗滌處理[28]，HPLC檢測(cè)。亞油酸β-谷甾醇酯的油溶度計(jì)見式（2）：

式中：M為茶籽油總質(zhì)量；M1為總亞油酸β-谷甾醇酯的質(zhì)量；M0為油空白亞油酸β-谷甾醇酯的質(zhì)量。同理，計(jì)β-谷甾醇的油溶度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0軟件作圖，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3 次采，數(shù)據(jù)以f s表示，采用獨(dú)立本t檢驗(yàn)，用SPSS 17.0分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異，P＜0.05， 差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酸醇物質(zhì)的量比對(duì)酯化率的影響

從圖2可以看出，酯化率隨著酸醇物質(zhì)的量比的增大先減小后增大，酸醇物質(zhì)的量比等于1∶1時(shí)酯化率最低為52.31%。當(dāng)酸醇物質(zhì)的量比小于1∶1時(shí)，即逐漸增加體系中β-谷甾醇的濃度，亞油酸的轉(zhuǎn)化率增大；當(dāng)酸醇物質(zhì)的量比大于1∶1時(shí)，即逐漸增加體系中亞油酸的濃度， β-谷甾醇的轉(zhuǎn)化率增大，酯化反應(yīng)程度隨著酸醇物質(zhì)的量比的增加而增加[30]，平衡向減少反應(yīng)物的方向移動(dòng)，即正向移動(dòng)，符合勒夏特列原理[31]。當(dāng)酸醇物質(zhì)的量比達(dá)到2∶1時(shí)，酯化率已基本達(dá)到最高為78.82%，繼續(xù)增加亞油酸的濃度，酯化率不再有明顯的提高，可能是β-谷甾醇的轉(zhuǎn)化率已達(dá)到最大，酸醇物質(zhì)的量比2∶1為單因試驗(yàn)最優(yōu)水平。

圖 2 酯化率與酸醇物質(zhì)的量比的關(guān)系Fig. 2 relationship between esterification rate and molar ratio of acid to alcohol

2.1.2 微波加熱時(shí)間對(duì)酯化率的影響

圖 3 酯化率與微波加熱時(shí)間的關(guān)系Fig. 3 Relationship between esterification rate and microwave heating time

從圖3可以看出，微波加熱時(shí)間在1～4 min時(shí)，酯化率由10.06%增長(zhǎng)到80.12%，酯化反應(yīng)程度隨著微波加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而更加徹底，所以酯化率逐漸增高。當(dāng)微波加熱時(shí)間為4 min時(shí)，酯化反應(yīng)達(dá)到平衡，酯化率基本達(dá)到最高，繼續(xù)延長(zhǎng)微波加熱時(shí)間，酯化率不再提高反而有所下降，可能是因?yàn)殡S著微波加熱時(shí)間延長(zhǎng)酯化反應(yīng)過程中生成了一些副反應(yīng)物質(zhì)[32]，因微波加熱時(shí)間 4 min為單因試驗(yàn)最優(yōu)水平。

2.1.3 微波加熱次數(shù)對(duì)酯化率的影響

從圖4可以看出，隨著微波加熱次數(shù)的增加，酯化率逐漸提高，由微波加熱1 次的34.11%增加到78.22%（加熱4 次），微波加熱次數(shù)的增加即是對(duì)整體加熱時(shí)間的增加，在一定時(shí)間內(nèi)酯化反應(yīng)程度隨著總體微波加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而更加徹底，所以酯化率逐漸增高，體現(xiàn)了微波的熱效應(yīng)[33]。當(dāng)微波加熱次數(shù)為4 次時(shí)，酯化率已基本達(dá)到最高，繼續(xù)增加加熱次數(shù)，酯化率不再有明顯的提高，證明當(dāng)反應(yīng)已基本達(dá)到平衡時(shí)微波并不能改變反應(yīng)平衡常數(shù)[34]，因微波加熱次數(shù)4為單因試驗(yàn)最 優(yōu)水平。

圖4 酯化率與微波加熱次數(shù)的關(guān)系Fig. 4 Relationship between esterification rate and number of microwave heating cycles

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)酯化率的影響

圖 5 酯化率與超聲時(shí)間的關(guān)系Fig. 5 Relationship between esterification rate and ultrasonic irradiation time

從圖5可以看出，沒有超聲波輔助時(shí)，合成亞油酸β-谷甾醇酯的酯化率僅為54.11%，引入超聲波輔助（0～150 s）后，酯化率顯著提高，超聲90 s時(shí)酯化率達(dá)到76.18%證明超聲波酯化反應(yīng)具有較明顯的促進(jìn)作用。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是自然狀況下β-谷甾醇粉末與亞油酸在反應(yīng)體系中分為明顯的兩相，而酯交換反應(yīng)只能在兩相界面發(fā)生，亞油酸較為黏稠，有很大的傳質(zhì)阻力，超聲波具有強(qiáng)大的傳質(zhì)和乳化作用，可以降低反應(yīng)的活化能[35]，并且可以促進(jìn)羥自由基和甲氧基的產(chǎn)生，從而強(qiáng)化酯交換反應(yīng)進(jìn)程[36-37]。當(dāng)超聲時(shí)間為120 s時(shí)，酯化率為75.24%，有稍許降低，其原因可能是經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的間斷加熱，超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)[38]小于反應(yīng)體系降低的熱量，等于間接短時(shí)間降低了反應(yīng)溫度，導(dǎo)致酯化率稍有下降。而在超聲時(shí)間為150 s時(shí)，超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)在一定程度上彌補(bǔ)了反應(yīng)體系降低的熱量，因酯化率又有所回升達(dá)到76.22%。整體來看，當(dāng)超聲90 s時(shí)，酯化率基本達(dá)到最高，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，酯化率不再有明顯提高，因超聲時(shí)間90 s為單因試驗(yàn)最優(yōu)水平。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表 2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 L9(34) orthogonal array design with experimental results

從表2可知，RB＞RA＞RC＞RD，所以影響反應(yīng)因的主次為B＞A＞C＞D，即每次微波加熱時(shí)間＞酸醇物質(zhì)的量比＞微波加熱次數(shù)＞超聲時(shí)間。最佳工藝組合為：A3B3C2D2，即酸醇物質(zhì)的量比2.2∶1、每次微波加熱時(shí)間5 min、微波加熱4 次、每次超聲90 s。

2.3 最佳工藝條件驗(yàn)證

按照正交試驗(yàn)得到的最佳合成工藝條件，即酸醇物質(zhì)的量比為2.2∶1，每次微波加熱時(shí)間5 min，微波加熱4 次，每次超聲90 s 進(jìn)行酯化反應(yīng)，平行做3 次實(shí)驗(yàn)，酯化率為（89.56f 1.24）%，高于正交試驗(yàn)中各試驗(yàn)結(jié)果，表明該最佳合成工藝條件能提高亞油酸β-谷甾醇酯的酯化率。

2.4 反應(yīng)產(chǎn)物的定性分析

2.4.1 HPLC分析

圖 6 β-谷甾醇HPLC圖Fig. 6 HPLC profile of β-sitosterol

圖 7 亞油酸β-谷甾醇酯HPLC圖Fig. 7 HPLC profile of linoleyl β-sitosterol

圖6 為β-谷甾醇的HPLC圖，保留時(shí)間為14.397 min，圖7為分離純化后的亞油酸與β-谷甾醇反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖，其中有且只有一個(gè)，且其保留時(shí)間為26.098 min，證明非β-谷甾醇。在分離純化過程中過量的飽和KHCO3溶液可以充分洗去產(chǎn)物中未反應(yīng)完全的亞油 酸[28]，又由于亞油酸β-谷甾醇酯的極性小于β-谷甾醇，在反向色中極性強(qiáng)的組分先流出，且與亞油酸β-谷甾醇酯高純品的出時(shí)間一致，所以保留時(shí)間為26.098 min的可能為高純度的亞油酸β-谷甾醇酯。

2.4.2 FTIR分析

圖 8 β-谷甾醇FTIR譜圖Fig. 8 Infrared spectrum of β-sitosterol

圖 9 亞油酸β-谷甾醇酯FTIR譜圖Fig. 9 Infrared spectrum of linoleyl β-sitosterol

表 3 元素分析結(jié)果Table 3 Results of element analysis%

2.4.4 NMR鑒定結(jié)果'

圖 10 亞油酸β-谷甾醇酯結(jié)構(gòu)圖Fig. 10 Structure of linoleyl β-sitosterol

圖 11 β-谷甾醇的1H-NMRFig. 11 1H-NMR profile of β-sitosterol

圖 12 亞油酸β-谷甾醇酯的1H-NMRFig. 12 1H-NMR profile of linoleyl β-sitosterol

亞油酸β-谷甾醇酯的結(jié)構(gòu)圖見圖10，β-谷甾醇和亞油酸β-谷甾醇酯的核磁圖分別見圖11和圖12，經(jīng)過分析兩者C2、C3、C4和C9位置上的質(zhì)子化學(xué)位移（表4），發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇在這些位置上的化學(xué)位移均小于亞油酸β-谷甾醇酯相應(yīng)位置上的質(zhì)子化學(xué)位移，這是因?yàn)闅湓拥碾娯?fù)性小于酯基的電負(fù)性。酯基的存在對(duì)質(zhì)子產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)，酯基附近的H電子云密度降低，屏蔽效應(yīng)減弱，質(zhì)子靠近低場(chǎng)出，化學(xué)位移增大。

表 4 幾種不同環(huán)境的質(zhì)子化學(xué)位移Table 4 Chemical shifts of protons in β-sitosterol and linoleyl β-sitosterol in different environments

經(jīng)積分得出β-谷甾醇的C2C9、C3、C4上的質(zhì)子質(zhì)量比是2.99∶1∶1.98，約為3∶1∶2，C2和C9上的質(zhì)子化學(xué)位移相同，經(jīng)推測(cè)C2和C9質(zhì)量比為2∶1，符合β-谷甾醇的結(jié)構(gòu)式。亞油酸β-谷甾醇酯中C2和C9上的質(zhì)子化學(xué)位移不同，是由于酯基對(duì)C2上的質(zhì)子有更強(qiáng)的誘導(dǎo)效應(yīng)，且其C2、C3、C4、C9上的質(zhì)子質(zhì)量比是2.02∶1.00∶2.02∶1.00，約為2∶1∶2∶1，符合亞油酸β-谷甾醇酯的結(jié)構(gòu)式。

δ=0.897（s，J＝0.99，6H）、0.923（s，J＝0.92，6H）、1.016（s，J＝1.02，3H）、1.165（s，J＝1.16，3H）、1.299（s，J＝1.30，9H）、1.304（s，J＝1.30，10H）、1.314（s, J＝1.30，6H）、1.341（s，J＝1.34，2H）、1.363（s，J＝1.36，3H）、1.456（s，J＝1.46，1H）、1.49（s，J＝1.49，2H）、1.62（s，J＝1.62，5H）、1.83（s，J＝1.83，2H）、1.902（s，J＝1.90，1H）、1.943（s，J＝1.95，2H）、1.994（s，J＝1.99，1H）、2.015（d，J＝2.01，2H）、2.064（d， J＝2.04，4H）、2.36（m，2H）、2.400（m，2H）、2.768 （t，J＝2.77，2H）、4.62（s，J＝4.62，1H）、5.304（s，J＝5.33，1H）、5.334（d，J＝5.37，2H）、5.403（s，J＝5.39，2H）。

2.5 HPLC定量分析

將0.02、0.08、0.16、0.24、0.28、0.32 mg/mL的高純亞油酸β-谷甾醇酯溶液依次進(jìn)，測(cè)定方法參考1.3.5.1節(jié)。分別以亞油酸β-谷甾醇酯溶液的面積和濃度作為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝1 428x36.58，R2＝0.999 6。最后測(cè)得合成的亞油酸β-谷甾醇酯經(jīng)過分離純化后的純度為98.36%。2.6 油溶性分析

圖 13 β-谷甾醇和亞油酸β-谷甾醇酯的溶解度Fig. 13 Solubilities of β-sitosterol and linoleyl β-sitosterol

3 結(jié) 論

本研究?jī)?yōu)化亞油酸β-谷甾醇酯的最佳合成條件為酸醇物質(zhì)的量比2.2∶1、每次微波加熱時(shí)間5 min、微波加熱4 次、每次超聲90 s，酯化率為89.56%。所得產(chǎn)物經(jīng)過分離純化后，用HPLC分析知產(chǎn)物中無未反應(yīng)完的β-谷甾醇，經(jīng)過FTIR分析知反應(yīng)中生成了酯，經(jīng)過元分析知產(chǎn)物與所求證化合物及其吻合，經(jīng)過NMR分析產(chǎn)物確證為亞油酸β-谷甾醇酯。最后，經(jīng)過HPLC測(cè)定產(chǎn)物純度為98.36%，在茶籽油（25 ℃）中的溶解度為33.68%，相比于β-谷甾醇（1.33%）提高了25 倍，可以更廣泛的應(yīng)用于食品、化妝品、保健品領(lǐng)域。至于亞油酸β-谷甾醇酯的具體的生物活性以及亞油酸和β-谷甾醇合成的亞油酸 β-谷甾醇酯在降血脂方面能否產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)可以進(jìn)行更加深入的研究。本合成工藝簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，不使用額外的催化劑，為合成甾醇酯類產(chǎn)品開辟了更加綠色、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)潔、高效的途徑。