HS-SPME與GC-MS聯(lián)用分析食品中二甲基硒和二甲基二硒*

龔 亮，李興寧，張世博，熊 珺，余以剛

(1 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2 廣東省東莞市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心， 廣東 東莞 523808；3 華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東 廣州 510640)

完整的樣品分析分為四步，即樣品的采集、前處理、分析測(cè)定和數(shù)據(jù)處理及報(bào)告結(jié)果。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，各步驟占全部分析時(shí)間的比列分比為6%、61%、6%和27%。由此看出，各步驟所需的時(shí)間相差很大，樣品前處理所需的時(shí)間最長(zhǎng)，約占整個(gè)分析時(shí)間的三分之二[1]。此外，樣品的前處理是銜接樣品采集和樣品的分析測(cè)定，即有效的提取、凈化和濃縮樣品中待測(cè)成分并與后序的檢測(cè)方法如光譜、色譜、電化學(xué)等相匹配的操作過(guò)程?？梢?jiàn)，樣品前處理是分析過(guò)程中最重要的一環(huán)，也是分析中最耗時(shí)、最復(fù)雜的一步，其質(zhì)量對(duì)整個(gè)分析檢測(cè)的速度和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度和可靠性影響極大。

近年來(lái)發(fā)展的新型樣品前處理技術(shù)如固相微萃取(Solid phase microextraction，SPME)[2]、攪拌棒吸附萃取(Stir bar sorptive extraction，SBSE)[3]、毛細(xì)管微萃取(Capillary microextration，CME)[4]、超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)[5]、微波輔助萃取(Microwave assisted extraction，MAE)[6]和液相微萃取(Liquid phase microextraction，LPME)[7]等，大多朝著富集倍數(shù)大、綠色環(huán)保、簡(jiǎn)單易用、靈敏度高的方向發(fā)展，并通過(guò)與分析儀器的聯(lián)用實(shí)現(xiàn)高效自動(dòng)化分析。SPME萃取原理基于待測(cè)物質(zhì)在樣品及萃取涂層中平衡分配的萃取過(guò)程。SPME有兩種萃取模式，其一是將萃取纖維頭直接浸沒(méi)在樣品溶液中，即直接SPME；另一種是將萃取纖維頭懸掛于樣品溶液上空，萃取上方氣相中的揮發(fā)性物質(zhì)，稱為頂空SPME(HS-SPME)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)具有操作簡(jiǎn)單、分離度和選擇性好、靈敏度高和分析速度快以及適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在痕量組分分析中得到廣泛應(yīng)用。本論文的研究目的是，以GC-MS為后續(xù)分離檢測(cè)手段，系統(tǒng)研究揮發(fā)性有機(jī)硒在HS-SPME中的萃取行為，進(jìn)而建立HS-SPME與GC-MS聯(lián)用測(cè)定食品中揮發(fā)性硒化合物(二甲基硒(DMSe)和二甲基二硒(DMDSe))的新方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器裝置及工作條件

Agilent 7890A型氣相色譜儀-5975 C質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)；DB-5ms石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；SY1200超聲儀，上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；85-2A型磁力加熱攪拌器，江蘇榮華儀器制造有限公司；A11型研磨儀，意大利IKA公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、復(fù)合50/30 DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國(guó)Supelco公司；頂空樣品瓶(20 mL)。

升溫程序：初溫35 ℃保持4 min，以15 ℃/min升至125 ℃保持5 min，以20 ℃/min升至240 ℃保持3 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；進(jìn)樣分流比2:1的方式分流進(jìn)樣；使用高純氦作為載氣，在恒流模式下柱流量為1.1 mL/min；電離模式：能量為70 eV的電子轟擊源；離子源溫度為200 ℃。

掃描方式：采用全掃描和選擇離子同時(shí)采集的掃描模式，二甲基硒的特征離子為m/z 80、91、95和110。選擇不同的離子通道，以m/z 95作為DMSe定量離子，以m/z 80、90和110作為DMSe定性鑒別離子；二甲基二硒的特征離子為m/z 93、109、160、175和190。選擇不同的離子通道，以m/z 190作為DMDSe定量離子，以m/z 93、109、160和175作為DMDSe定性鑒別離子。

1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

DMSe和DMDSe標(biāo)準(zhǔn)品(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，純度大于98.0%)。用甲醇溶解稀釋配制成10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光冷藏待用。實(shí)際工作溶液由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。甲醇、氯化鈉以及其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為超純水(18.2 MΩ·cm，美國(guó)Millipore超純水機(jī)制得)。

1.3 實(shí)驗(yàn)操作

DVB/CAR/PDMS固體微萃取頭的老化：先將萃取頭浸沒(méi)在丙酮中，30 min后取出，然后將其放置在250 ℃下老化30 min，待用。

萃取步驟：將預(yù)處理好的樣品溶液在室溫25 ℃下恒溫30 min，然后取15 mL于頂空瓶中，瓶中預(yù)先放入1.5 cm長(zhǎng)的攪拌磁子，用特氟龍/硅膠隔墊密封后鋁蓋壓緊封口，將頂空瓶放置于磁力攪拌器上。然后將預(yù)先老化好的固相微裝置刺穿瓶蓋內(nèi)密封的隔墊，用夾子固定固相微萃取手柄，將纖維頭推出，使其置于工作溶液液面中心處上方約1.0 cm處，開(kāi)啟攪拌器，在室溫下萃取15 min后，取出萃取頭后馬上插入GC-MS的進(jìn)樣口，在250 ℃下解析5 min。SPME萃取手柄及微萃取頭如圖1所示。

1.4 樣品的采集及前處理

飲用水、果汁、洋蔥和大蒜購(gòu)買于當(dāng)?shù)卮笮统?東莞，中國(guó))。液體樣直接取15 mL置于頂空瓶中，按2.3步驟進(jìn)行萃取和分析；洋蔥和大蒜稱取經(jīng)研磨儀粉碎后的樣品3.0 g加超純水定容至15 mL，于超聲儀中超聲10 min后立刻按2.3步驟進(jìn)行萃取和進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 頂空萃取條件的優(yōu)化

在固相微萃取中，萃取時(shí)間、攪拌速率、樣品體積、萃取溫度和體系中的離子強(qiáng)度等因素都可能對(duì)目標(biāo)分析物的萃取效率產(chǎn)生影響。因此，通過(guò)對(duì)以上各因素進(jìn)行考察以確定最佳的萃取條件。

2.1.1 萃取時(shí)間

實(shí)驗(yàn)中考察了萃取時(shí)間在2～30 min范圍內(nèi)對(duì)DMSe和DMDSe萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)分析物萃取效率的影響

由圖2萃取率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)可知，在2～15 min內(nèi)，DMSe和DMDSe的萃取效率隨萃取時(shí)間的增加而迅速增大；當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間至30 min，DMSe和DMDSe的萃取效率緩慢提高；15 min、20 min、25 min、30 min四個(gè)萃取時(shí)間之間無(wú)顯著性差異(p>0.05)，并與其它時(shí)間2 min、5 min、10 min均有顯著性差異。綜上分析，在非平衡態(tài)微萃取中，萃取時(shí)間是影響分析物萃取效率的重要因素。因此，兼顧分析效率，選擇15 min 作為HS-SPME的萃取時(shí)間。

2.1.2 攪拌速率

實(shí)驗(yàn)中考察了攪拌速率(200～1200 rpm)對(duì)DMSe和DMDSe萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 攪拌速率對(duì)分析物萃取效率的影響

由圖3萃取率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)可知，DMSe和DMDSe萃取效率隨攪拌速度的增大先顯著提高后趨于平緩。除攪拌速率為1000 rpm與1200 rpm之間無(wú)顯著性差異外(p>0.05)，其他各轉(zhuǎn)速之間萃取率差異顯著(p<0.05)。在對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的頂空微萃取中，攪拌速率的增加，有利于加速其揮發(fā)，從而縮短達(dá)到萃取平衡的時(shí)間，提高萃取效率和分析速度。結(jié)合磁力攪拌器的性能，為獲得更穩(wěn)定的萃取效果，實(shí)驗(yàn)選用1200 rpm作為萃取DMSe和DMDSe攪拌速率。

2.1.3 樣品體積

在樣品瓶總體積為20 mL的條件下，實(shí)驗(yàn)考察了樣品體積分別為3、6、9、12、15 mL時(shí)對(duì)DMSe和DMDSe萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 樣品體積對(duì)分析物萃取效率的影響

結(jié)果表明，DMSe和DMDSe的萃取效率隨樣品體積的增加而顯著升高，樣品各體積之間的萃取效果均具有顯著性差異(p<0.05)。采用頂空進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣瓶總體積固定，水相體積占比越大，空氣相占比越小，液/氣相比升高，揮發(fā)性的待測(cè)分析物在頂空氣相濃度增大，從而更易于被萃取。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇樣品溶液體積為15 mL。

2.1.4 萃取溫度

實(shí)驗(yàn)中考察了萃取溫度(25～50 ℃)對(duì)分析物萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

結(jié)果表明，萃取溫度的改變對(duì)DMSe和DMDSe的萃取效率無(wú)明顯的變化，萃取溫度在25～50 ℃之間無(wú)具有顯著性差異(p>0.05)。通常萃取溫度也是影響分析物萃取效率的重要因素之一，在HS-SPME的動(dòng)態(tài)萃取中，萃取溫度既影響待測(cè)物在萃取纖維上的吸附速度，同時(shí)對(duì)其在萃取纖維上的解吸速度也有影響；但是，溫度升高時(shí)，具有揮發(fā)性的待測(cè)組分的氣水分配系數(shù)也會(huì)降低。因此根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇在25 ℃室溫下對(duì)DMSe和DMDSe進(jìn)行HP-SPME。

圖5 萃取溫度對(duì)分析物萃取效率的影響

2.1.5 離子強(qiáng)度

除上述因素外，待測(cè)物的萃取效率還受溶液離子強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)考察了氯化鈉含量分別為0、5%、10%、15%、20%時(shí)對(duì)DMSe和DMDSe萃取效率得影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 離子強(qiáng)度對(duì)分析物萃取效率的影響

由圖6萃取率隨離子強(qiáng)度的變化趨勢(shì)可知，DMSe和DMDSe的萃取效率隨樣品中氯化鈉含量的增大先顯著上升后趨于平緩，氯化鈉含量在0～20%之間對(duì)萃取效率有顯著性影響(p<0.05)，氯化鈉含量為20%與25%之間已無(wú)顯著性差異(p>0.05)。在水溶液中，隨著離子強(qiáng)度的增加，目標(biāo)分析物DMSe和DMDSe在水中的溶解度降低，因此升高氣水分配系數(shù)，從而有利于增加在空氣相的濃度。綜上分析，為獲得良好的萃取效率，選擇樣品溶液含20%氯化鈉的離子強(qiáng)度下進(jìn)行HS-SPME。

2.2 分析性能

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化，最佳HS-SPME萃取條件為：移取15 mL的樣品溶液于20 mL頂空瓶中，加入3.0 g的氯化鈉和攪拌磁子，密封樣品瓶，在室溫下恒溫放置0.5 h。然后將含有DVB/CAR/PDMS萃取纖維的萃取手柄刺穿樣品瓶瓶蓋，推出纖維頭，并使其懸掛在樣品溶液中心上方1 cm處，并將樣品瓶放置于磁力攪拌器上。開(kāi)啟攪拌器，1200 rpm的攪拌速率攪拌樣品溶液，萃取15 min后，取出萃取頭后立即插入GC-MS的進(jìn)樣口，在進(jìn)樣口溫度250 ℃下解析5 min。在此萃取條件下，以三倍的信噪比為方法的檢出限，本方法的分析性能如表1所示?？梢?jiàn)，本方法對(duì)DMSe和DMDSe的檢出限分別為0.0570 μg/kg和0.0132 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs，n=7)為8.5%和7.1%。

表1 方法的分析性能

注：DMSe和DMDSe的濃度：0.80 μg/kg，0.20 μg/kg

2.3 實(shí)際樣品分析

將所建立的HS-SPME-GC-MS方法應(yīng)用于飲用水、果汁、大蒜、洋蔥等食品中的揮發(fā)性有機(jī)硒的測(cè)定。從表2可以看出，蒸餾水、礦泉水、橙汁和葡萄汁中均未檢出DMSe和DMDSe，洋蔥中檢出DMSe，其含量為2.08 μg/kg，大蒜中檢出了DMSe和DMDSe，其含量分別為4.87 μg/kg和0.25 μg/kg，對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收，其加標(biāo)回收率為88.6%～102.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs，n=3)為7.1%～9.4%。

表2 樣品分析

注：N.D.表示未檢出。

3 結(jié) 論

(1)以二乙烯苯-碳分子-聚二甲基硅氧烷為固相微萃取的吸附涂層，通過(guò)優(yōu)化萃取時(shí)間、萃取溫度、攪拌速度、離子強(qiáng)度等萃取因素，建立了頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定食品中揮發(fā)性有機(jī)硒(DMSe和DMDSe)的新方法。該方法對(duì)DMSe和DMDSe的檢出限分別為0.0570 μg/kg和0.0132 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs，n=7)為8.5%和7.1%。

(2)將本方法應(yīng)用于飲用水、果汁、大蒜和洋蔥等食品中的DMSe和DMDSe的分析并進(jìn)行加標(biāo)回收，其中洋蔥中檢出DMSe為2.08 μg/kg，大蒜中檢出了DMSe和DMDSe分別為4.87 μg/kg和0.25 μg/kg，加標(biāo)回收率在88.6%～102.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs，n=3)7.1%～9.4%，適用于食品中揮發(fā)性有機(jī)硒的測(cè)定。