3種重金屬對斑馬魚的聯(lián)合毒性及迷迭香酸的保護(hù)作用研究

宋明霞,陳天榮,錢豪文,許 波

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院線粒體健康與衰老研究中心,煙臺大學(xué),山東 煙臺 264005)

水環(huán)境是各種污染物的綜合受體,其中重金屬污染物會在生物體內(nèi)富集,最終通過食物鏈富集到人體內(nèi),對人體產(chǎn)生致畸、致癌、致突變的作用．城市污水是工業(yè)廢水和生活污水的混合體,被多種重金屬污染的水體會發(fā)生復(fù)雜的聯(lián)合毒性效應(yīng)[1]．

迷迭香酸(Rosmarinic acid)是一種具有多種生物活性的天然水溶性酚類化合物,廣泛存在于迷迭香、紫蘇、夏枯草、丹參、鼠尾草、薄荷植物中，具有許多藥理活性，如抗菌抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗輻射抗腫瘤、抗氧化及清除自由基、抑制黃嘌呤氧化酶、保肝護(hù)肺等[2-6]．

斑馬魚(Daniorerio)屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(Danio),是生物醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)模型的最佳的模式生物之一[7-11]．本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動物,探索多種重金屬聯(lián)合誘導(dǎo)斑馬魚發(fā)育毒性特性,研究天然抗氧化劑迷迭香酸對重金屬致斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

AB系斑馬魚由北京大學(xué)張博教授惠贈,由本實(shí)驗(yàn)室繁育保種,成年斑馬魚飼養(yǎng)于獨(dú)立養(yǎng)殖單元(北京愛生),水溫28.5±0.5 ℃,鹽度450～500 μS,pH值 7.0,光照周期為14 h/10 h(明/暗)交替循環(huán)．每日早晚各飼喂一次新鮮孵化的豐年蝦．收集的卵置于平板培養(yǎng)皿中,去除死卵、糞便和其他雜物,用E3(0.17 mol/L KCl,5 mmol/L NaCl,0.33 mmol/L MgSO4,0.33 mmol/L CaCl2,pH值7.4)洗滌數(shù)次,轉(zhuǎn)移到28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),及時(shí)移除未受精和死卵并換水,未受精的卵或死卵呈白色,正常胚胎呈透明狀．

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、CdCl2、CuSO4購自天津瑞金特;Pb(NO3)2購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;0.25 %EDTA胰蛋白酶細(xì)胞消化液、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;膠原蛋白酶Ⅱ購自Solarbio;胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司;迷迭香酸(RA)購自Life Technologies,熒光定量試劑盒SYBR?premix Ex TaqTMⅡ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimescriptTM RT reagent kit)均購自Takara公司．

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

Step One plus 熒光定量PCR儀為AB公司產(chǎn)品;AE31型熒光倒置顯微鏡為Motic公司產(chǎn)品;SpectraMax?Paradigm?Multi-Mode Detection Platform型多功能酶標(biāo)儀為Molecular devices公司產(chǎn)品;SMZ800型體視顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品;HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)為安徽中科公司產(chǎn)品;ACAE NovoCyteTM系列流式細(xì)胞儀為ACEC Biosciences公司產(chǎn)品;斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)為北京愛生產(chǎn)品;體式顯微鏡為南京江南永新光學(xué)有限公司產(chǎn)品;PHS-3C型PH計(jì)為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;6孔細(xì)胞培養(yǎng)板．

1.4 毒性實(shí)驗(yàn)

1.4.1 胚胎染毒實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]方法,收集受精后2 h(2 hpf)斑馬魚胚胎,置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,30枚/孔．每孔分別加入含有不同測試樣品E3溶液3 mL,另設(shè)只加E3培養(yǎng)液孔作為正常對照,每處理組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔．將培養(yǎng)板置于28.5 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi),每24 h更換新培養(yǎng)液,以卵黃凝結(jié)、心跳停止為胚胎死亡終點(diǎn),記錄各組胚胎死亡情況,及時(shí)吸掉死亡胚胎．至96 hpf胚胎完全孵化后,觀察畸形幼魚數(shù)量并拍照記錄．統(tǒng)計(jì)24,48,72和96 hpf時(shí)的死亡數(shù),計(jì)算96 hpf胚胎死亡率．

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,建立藥物濃度對死亡概率的回歸方程．計(jì)算出96 hpf的LC50值．

1.4.2 重金屬聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單一重金屬對斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)結(jié)果,按照1∶1的混合比例設(shè)置Cd2+、Cu2+、Pb2+兩兩之間聯(lián)合試驗(yàn)的質(zhì)量濃度,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用等毒性配比法,按毒性單位1∶1的比例混合,并對Cd2+、Cu2+、Pb2+的聯(lián)合毒性進(jìn)行評價(jià)．

1.4.3 RA聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)處理組:Control組、Cd2+-Pb2+-Cu2+重金屬聯(lián)合組、60 μmol/L RA與Cd2+-Pb2+-Cu2+重金屬聯(lián)合處理組、60 μmol/L RA組．將培養(yǎng)板置于28.5 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi),每24 h更換新測試溶液,并以卵黃凝結(jié)、心跳停止做為胚胎死亡終點(diǎn),記錄不同測試組中胚胎死亡數(shù)量,及時(shí)棄除死亡胚胎．至96 hpf胚胎完全孵化后,體視顯微鏡下觀察幼魚的畸形數(shù)量并拍照記錄．計(jì)算96 hpf死亡率．

1.5 胚胎凋亡的檢測

按照1.4.3的處理方法,將4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的胚胎處理24 hpf后,在解剖鏡下將卵膜剝離,0.25 %EDTA胰蛋白酶消化為單個(gè)細(xì)胞,按照試劑盒使用說明書操作,流式細(xì)胞儀檢測熒光水平．

1.6 胚胎Bcl-2/Bax、Capases 3基因表達(dá)的檢測

采用Real time-PCR方法檢測斑馬魚胚胎細(xì)胞Bcl-2/Bax基因表達(dá)水平．引物均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司．按照1.4.3的處理方法,將4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的胚胎處理至96 hpf后,TRIzol法提取總RNA,A260/A280為1.8～2.0,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA．

SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組胚胎基因表達(dá)情況,基因表達(dá)的相對定量用比較Ct值法[12],用內(nèi)參基因β-actin來校正差異,變化的倍數(shù)為2-ΔΔCt．計(jì)算公式為變化倍數(shù)=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)藥物處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)Control．PCR反應(yīng)體系為20 μL:SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、前引1 μL、后引1 μL、模板1 μL、ddH2O 6.6 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL;反應(yīng)條件為:預(yù)變性,95 ℃, 10 min；變性,95 ℃,15 s；退火,60 ℃,1 min,重復(fù)40個(gè)循環(huán)．

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 20.0軟件求出平均死亡率(換算成概率單位)與實(shí)驗(yàn)用水的重金屬質(zhì)量濃度對數(shù)回歸方程、斑馬魚胚胎96 hpf的半數(shù)致死濃度(LC50)和95 %的置信區(qū)間．

安全質(zhì)量濃度由公式SC=96 hpf-LC50×f求出,由于Cd2+、Cu2+、Hg+、Pb2+、Zn2+、Cr3+屬難分解、蓄積性強(qiáng)、毒性較大的物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)f值取0.01[13];運(yùn)用Origin 8.0對斑馬魚胚胎死亡數(shù)據(jù)作圖．

聯(lián)合毒性按S=(Am/A)+(Bm/B)公式計(jì)算,S為聯(lián)合毒性,A、B為單一毒性的LC50值,Am、Bm為混合毒性的LC50值．聯(lián)合毒性按Marking的相加指數(shù)法[14]評價(jià),相加指數(shù)AI=(1/S)-1(當(dāng)S≤1時(shí));AI=S×(-1)+1(當(dāng)S>1時(shí));用AI判斷聯(lián)合毒性,當(dāng)AI=0時(shí),為毒性相加作用;當(dāng)AI<0時(shí)為拮抗作用;當(dāng)AI>0時(shí)為協(xié)同作用．

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 單一重金屬急性毒性實(shí)驗(yàn) Cd2+、Cu2+、Pb2+3種重金屬對斑馬魚的毒性的回歸分析見表1,Cd2+、Cu2+、Pb2+對斑馬魚胚胎的毒性96 hpf-LC50分別為26.11、3.755、271.984 mg/L,安全濃度分別為261.1、37.55、2 719.84 μg/L．

表1 Cd2+、Cu2+和Pb2+對斑馬魚胚胎毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析結(jié)果

2.1.2 重金屬Cd2+-Pb2+的聯(lián)合急性毒性實(shí)驗(yàn) 對聯(lián)合毒性的概率單位-濃度對數(shù)值進(jìn)行線性回歸分析(表2),Cd2+和Pb2+共存時(shí)對斑馬魚胚胎96 hpf-LC50分別為16.534 mg/L、89.997 mg/L,計(jì)算可得，AI為0.037,其聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用,Cd2+和Pb2+的聯(lián)合毒性大于單一的Cd2+或Pb2+的毒性．

表2 Cd2+和Pb2+對斑馬魚胚胎聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析結(jié)果

2.1.3 重金屬Cd2+-Cu2+的聯(lián)合急性毒性實(shí)驗(yàn) 對聯(lián)合毒性的概率單位-濃度對數(shù)值進(jìn)行線性回歸分析(表3),Cd2+和Cu2+共存時(shí)對斑馬魚胚胎96 hpf-LC50分別為13.808 mg/L和1.065 mg/L,計(jì)算可得，AI為0.114,其聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用,Cd2+和Cu2+聯(lián)合毒性大于單一的Cd2+或Cu2+的毒性．

表3 Cd2+和Cu2+對斑馬魚胚胎聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析結(jié)果

2.1.4 重金屬Cu2+-Pb2+的聯(lián)合急性毒性實(shí)驗(yàn) 對聯(lián)合毒性的概率單位-濃度對數(shù)值進(jìn)行線性回歸分析(表4),Cu2+和Pb2+共存時(shí)對斑馬魚胚胎96 hpf-LC50分別為2.735 mg/L、113.805 mg/L,計(jì)算可得，AI為-0.366,其聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用,Cu2+和Pb2+聯(lián)合毒性大于單一的Cu2+或Pb2+的毒性．

表4 Cu2+和Pb2+對斑馬魚胚胎聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析結(jié)果

2.1.5 重金屬Cd2+-Pb2+-Cu2+的聯(lián)合急性毒性實(shí)驗(yàn) 對聯(lián)合毒性的概率單位-濃度對數(shù)值進(jìn)行線性回歸分析(表5),Cd2+、Cu2+和Pb2+共存時(shí)對斑馬魚胚胎96 hpf-LC50分別為13.470 mg/L、3.551 mg/L、40.410 mg/L,計(jì)算可得AI為0.005,其聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用．

表5 Cd2+、Pb2+和Cu2+對斑馬魚胚胎聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析結(jié)果

2.1.6 RA與重金屬Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合的胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn) 如圖1所示，與空白對照組相比,Cd2+-Pb2+-Cu2+處理組對斑馬魚胚胎有明顯的致死效應(yīng)(P<0.01)，且胚胎死亡均發(fā)生于24 hpf之內(nèi)．與 Cd2+-Pb2+-Cu2+處理組相比,60 μmol/L的RA與Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合處理斑馬魚胚胎死亡率顯著下降(P<0.01);60 μmol/L的RA單獨(dú)處理組對斑馬魚胚胎死亡率無影響(P>0.05)．

圖1迷迭香酸聯(lián)合Cd2+-Pb2+-Cu2+暴露96 h對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性影響

Fig.1ToxiceffectsofresveratrolcombinedwithCd2+-Pb2+-Cu2+onzebrafishembryosdevelpment

2.2 RA與重金屬Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合致胚胎凋亡結(jié)果

由流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果可知(圖2),與空白對照組相比，Cd2+-Pb2+-Cu2+處理組中斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.01),與Cd2+-Pb2+-Cu2+處理組相比,60 μmol/L 的RA聯(lián)合Cd2+-Pb2+-Cu2+處理組斑馬魚胚胎細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率明顯下降．

2.3 RA與重金屬Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合致胚胎Bcl-2/Bax、Caspase 3基因表達(dá)結(jié)果

由PCR檢測結(jié)果可知(圖3和圖4),與空白對照組比較,Cd2+-Pb2+-Cu2+重金屬聯(lián)合處理斑馬魚胚胎組像中Bcl-2/Bax比值降低,Caspase3基因表達(dá)上調(diào)(P<0.05);與Cd2+-Pb2+-Cu2+重金屬處理組相比,采用60 μmol RA與Cd2+-Pb2+-Cu2+重金屬聯(lián)合處理斑馬魚,胚胎組織中Bcl-2/Bax比值升高,Caspase3基因表達(dá)下調(diào)(P<0.05)．

3 結(jié) 論

Cd2+,Pb2+,Cu2+單獨(dú)及聯(lián)合作用均對斑馬魚胚胎發(fā)育具有明顯的毒性效應(yīng),導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育阻滯、心臟水腫、卵黃囊水腫、脊柱彎曲、胚胎體型發(fā)育短小等多種發(fā)育異常,在3種重金屬聯(lián)合處理下,胚胎細(xì)胞凋亡率明顯上升．與Cd2+-Pb2+-Cu2+處理組相比,迷迭香酸與Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合處理組的斑馬魚胚胎死亡率明顯降低(P<0.01)，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01),Caspase3基因表達(dá)下調(diào)(P<0.05),說明迷迭香酸對Cd2+-Pb2+-Cu2+引起的胚胎發(fā)育毒性具有明顯的保護(hù)作用，通過改善氧化協(xié)迫狀態(tài)，上調(diào)Bcl-2/Bax和下調(diào)Caspase3基因表達(dá),從而對Cd2+-Pb2+-Cu2+所引發(fā)的細(xì)胞凋亡起到抑制作用．

圖3迷迭香酸聯(lián)合Cd2+-Pb2+-Cu2+對斑馬魚胚胎Bcl-2/Bax基因表達(dá)的影響

Fig.3RosemaryacidjointCd2+-Pb2+-Cu2+effectonzebrafishembryosBcl-2/Baxgeneexpression

圖4迷迭香酸聯(lián)合Cd2+-Pb2+-Cu2+對斑馬魚胚胎Caspase3基因表達(dá)的影響

Fig.4RosemaryacidjointCd2+-Pb2+-Cu2+effectonzebrafishembryosCaspase3geneexpression