快速光響應(yīng)曲線的優(yōu)化及在底棲甲藻光適應(yīng)特性研究中的應(yīng)用

黃凱旋, 陳 亨, 徐帥帥, 劉莎莎, 呂頌輝

(暨南大學(xué) 赤潮與海洋生物學(xué)研究中心, 廣東 廣州 510632)

底棲甲藻(benthic dinoflagellate)是指附著在海洋基底, 如沙礫、珊瑚、大型海藻、巖石等基質(zhì)上的甲藻生態(tài)類群[1]。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)水深0~5 m是底棲甲藻豐度最高區(qū)域[2], 這一區(qū)域因潮汐周期存在著復(fù)雜多變的光場。因此, 底棲甲藻的一個重要的挑戰(zhàn)是避免強光照射造成光損傷。在長期演變中, 藻類進化出一系列保護機制適應(yīng)強光照射, 其中非光化學(xué)淬滅(non-photochemical quench, NPQ)起到了重要的作用[3]。

NPQ主要是由葉黃素循環(huán), 通過去環(huán)氧化過程將部分光能以無損害的熱能形式耗散[4]。硅甲藻黃素循環(huán)是在甲藻和硅藻NPQ中已知的起到重要作用的葉黃素循環(huán), 占據(jù)將近90%的非光化能耗散[5]。該循環(huán)一個重要特點是較小的ΔpH差就可以驅(qū)動硅甲藻黃素的去環(huán)氧化[6]。因此相對于高等植物, 硅藻和甲藻的NPQ所需的光強更小, 并且誘導(dǎo)時間也更短[7-8]。此外, 黑暗或低光條件, 部分底棲硅藻的NPQ不會完全釋放, 甚至出現(xiàn)上升的情況, 稱之為黑暗NPQ (dark NPQ)[9], 類似的情況同樣在底棲甲藻中發(fā)現(xiàn)。通過以上不同的葉黃素循環(huán)機制, 使得硅甲藻的NPQ過程變得更為靈活, 能快速的響應(yīng)光環(huán)境變化[10]。

Beer等[11]發(fā)現(xiàn)光化反應(yīng)下的電子傳遞速率(electronic transport rate, ETR)與O2或CO2代謝有著密切的關(guān)系。以ETR繪制的光合作用曲線, 稱為快速光響應(yīng)曲線(rapid light curves, RLCs), 類似于以光合放氧為基礎(chǔ)的曲線。RLCs由一組上升的光強梯度組成, 通過葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)進行測定, 其中每個光強梯度一般不超過60 s, 整個過程不超過10 min, 因此適用于快速變化的光場[12]。RLCs能夠反映光合生物的長期或短期的光適應(yīng)情況, 因此RLCs在野外調(diào)查中已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用, 在大型海藻[13], 底棲微藻[14]和珊瑚[15]等底棲生物的調(diào)查中均起到重要的作用。但RLCs的測定中存在內(nèi)生的光適應(yīng), 能夠改變?nèi)~綠素a熒光的激發(fā), 進而導(dǎo)致ETR測定產(chǎn)生偏離。如初始PSII電子受體醌受體A(QA)的氧化或NPQ在RLCs測定過程中產(chǎn)生光適應(yīng),影響了熒光的測定, 甚至由于過高的NPQ導(dǎo)致曲線不飽和情況。Perkins等[16]提出用反序的光強梯度, 即光強下降的順序用于底棲硅藻的RLCs測定, 能一定程度降低內(nèi)生光合作用變化的影響, 更為真實的反映實際光合作用狀態(tài)。非序光曲線(non-sequence light curves, N-SLCs)是每一個光梯度均用單獨的, 未經(jīng)任何測定的樣品進行測定光曲線, 并且光梯度的測定無需按照順序進行測定[16-17]。由于每一個光梯度的樣品均是獨立的, 能基本去除內(nèi)生光適應(yīng)效應(yīng)。

本研究目標(biāo)是優(yōu)化RLCs程序, 減少RLCs內(nèi)生偏差, 改善RLCs技術(shù)在底棲甲藻的應(yīng)用。Coolia (Ostreopsidaceae, Dinophyceae)是全球分布并具有潛在毒性的底棲甲藻, 在我國亞熱帶海域廣泛分布[18]。本文選用Coolia tropicalis, 通過不同光背景短期馴化的細胞, 分別測定不同光序列結(jié)構(gòu)和不同光梯度時長的RLCs, 對比N-SLCs, 進而評估RLCs光曲線過程中誘導(dǎo)的快速光適應(yīng)的積累和反序RLCs的可行性。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

藻種Coolia tropicalis分離自海南島, 保種于暨南大學(xué)赤潮與海洋生物研究中心。細胞培養(yǎng)在f/2培養(yǎng)基加富的自然海水中, 培養(yǎng)溫度為25℃, 光強為100 μmol photons/(m2·s)(12 h/12 h, 光暗周期), 光強度由光度計QSI2100 (Biospherical Instrument Inc., USA)測定。取處于指數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 快速光響應(yīng)曲線測定

60 mL藻液分裝在玻璃試管(高20 cm, 半徑2 cm)中, 在LED(150 W)下照射60 min, 通過試管包裹不同層數(shù)的中性網(wǎng)獲得不同光強(210, 350, 400, 500, 800, 1 000 μmol photons /(m2·s)), 其中210和1 000 μmol photons/(m2·s)分別記作LL和HL用于顯示的RLCs曲線和NPQ誘導(dǎo)曲線結(jié)果。照射期間, 由循環(huán)水控溫裝置CA-1111(EYELA, Japan)進行控溫(25 )℃。取1 mL樣品于2 mL棕色離心管中黑暗15 min, 隨后測定快速光響應(yīng)曲線。

使用浮游植物分析儀Phyto-PAM(Walz, Germany)對葉綠素?zé)晒膺M行測定, 共設(shè)置64, 164, 264, 464, 664, 864, 1 264, 1 664和2 064 μmol photons/(m2·s) 9個光化光步數(shù), 每個光化光步長(即照射時間)為10, 30或60 s, 光化光序列采用3種序列, (1)正序(Up), 即光化光強度從低到高順序; (2)反序(Down), 即光化光強度從高到低順序; (3)非序(NS), 即每個光化光強度均由單獨的樣品進行測定, 不存在先后順序。每個序列3個重復(fù), 由3次獨立實驗完成。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

每一個光化光強度, 有效光化學(xué)效率(Yield’)由調(diào)制式飽和脈沖技術(shù)測定。200 ms、4 000 μmol photons/(m2·s)飽和脈沖能夠?qū)⒐庀到y(tǒng)II(PSII)受體側(cè)完全處于還原態(tài), 誘導(dǎo)實時熒光(F′)升高至最大熒光(Fm′):

Phyto-PAM提供4個波段的Yield’, 選取波段470 nm(由于甲藻含有葉綠素c和類胡蘿卜素, 520 nm同樣也激發(fā))的Yield’值用于計算相對電子傳遞速率(rETR):

式中1/2代表兩個光系統(tǒng)平分一個光子, PAR為光化光強度。

非光化學(xué)淬滅(NPQ)計算公式為:

硅甲藻黃素-硅藻黃素色素循環(huán)依賴的NPQ在黑暗中依舊能夠維持黑暗NPQ如通過葉綠體呼吸(chlororespiration)途徑。暗適應(yīng)測定的最大熒光產(chǎn)量Fm不能夠體現(xiàn)真實值。因此 NPQ計算用RLCs中的最大熒光產(chǎn)率Fm′max替代Fm[16]。

Phyto-PAM一個Gain水平上最高記錄1 870 units, Fm或Fm′超過1 870 units都記錄為1 870 units; 而在RLCs誘導(dǎo)過程中, Fm′信號低于100 units則會出現(xiàn)過載。因此, 過高或過低的F′信號都會導(dǎo)致NPQ值出現(xiàn)偏差。根據(jù)藻種的特性, 通過Gian的調(diào)整, 獲得大約500~600 units, F′信號可避免上述情況的發(fā)生。

1.3 統(tǒng)計分析

根據(jù)文獻[19], RLCs由公式(5)進行擬合。

式中Ps是與最大相對電子傳遞速率(rETRmax)相關(guān)參數(shù), I為光化光強度, α為初始斜率, β為抑制率。

數(shù)據(jù)由SPSS16.0的One-way Anova的Tukey或Duncan法進行統(tǒng)計分析, P<0.05為顯著。

2 結(jié)果

2.1 快速光響應(yīng)曲線

如圖1所示, 在LL(210 μmol photons/(m2·s))和HL(1000 μmol photons/(m2·s))光強條件馴化下, 非序和反序RLCs分別在光強664和864 μmol photons/ (m2·s)之后出現(xiàn)了光飽和或光抑制, 而正序RLCs并未出現(xiàn)光飽和或光抑制點。各RLCs序列的30 s和60 s的rETR之間無顯著差異(P>0.05), 二者均顯著高于10 s的rETR(HL的反序RLCs除外)(P<0.05)。 巧合的是, HL馴化下的反序和非序RLCs在30 s和60 s的曲線幾乎重合(圖1 d, f)。

圖1 步長和光序列對RLCs的影響 Fig. 1 Impact of light duration and sequence on rapid light curves

2.2 光合生理參數(shù)

對從6種光背景處理的光曲線所得出的α, rETRmax和Ek進行趨勢比較(圖2)。非序RLCs的α總體趨勢呈現(xiàn)隨光強的升高而降低, 其中60 s的顯著高于10 s和30 s的(P<0.05)(圖2 a, b, c)。反序和正序RLCs的α值高于非序RLCs(P<0.05), 并且在同一步長下表現(xiàn)相似的趨勢。其中10 s的趨勢與30 s和60 s的不同, 呈現(xiàn)出隨光強升高而先升高后降低的趨勢, 且反序RLCs的α顯著高于正序(P<0.05)。

三種序列的rETRmax值的排序為: 正序RLCs>反序RLCs>N-SLCs(P<0.05)。非序RLCs的rETRmax也隨著光強的升高而降低, 其中10 s的顯著低于30 s和60 s的(P<0.05)(圖2 d, e, f)。正反序RLCs的rETRmax趨勢為隨光強升高先輕微上升后下降。步長為30 s和60 s的正反序RLCs的rETRmax無顯著差異(P>0.05), 且均高于10 s(P<0.05)。

三種序列RLCs的α和rETRmax總體而言的趨勢是相似的, 但由rETRmax/α所得出的Ek趨勢出現(xiàn)分化(圖2 g, h, i)。30 s和60 s正序RLCs的Ek隨光強升高而升高, 與10 s的趨勢相反。非序和反序RLCs的Ek在光化光超過500 μmol photons/(m2·s)呈現(xiàn)下降趨勢(10 s, LL反序RLCs結(jié)果除外, 圖2 g), 在此之前維持不變或上升趨勢。

2.3 NPQ動力曲線

NPQ動力曲線受到序列方式和步長的影響。其中反序RLCs的曲線與正序和非序完全不同, 其存在3個階段的變化: 第一階段為光強降低, 但光強較強足以誘導(dǎo)NPQ, 呈現(xiàn)NPQ隨光強降低而升高; 第二階段為光強繼續(xù)降低, 當(dāng)光強不足以維持最大NPQ時, NPQ隨光強降低而降低; 第三階段為由于葉綠體呼吸在低光強下NPQ重新上升。由于HL馴化下的NPQ所需誘導(dǎo)的光強強度更低, 所以曲線并未顯示出第二階段(圖3 d)。正序和非序RLCs的NPQ均呈現(xiàn)隨光強升高而升高的趨勢, 但正序RLCs的NPQ上升速度遠高于非序RLCs。

正序RLCs在高光強部分的NPQ顯著高于反序和非序的(P<0.05)。正序RLCs的NPQ在光強2 064 μmol photons/(m2·s)時達到最大, 比較三種序列在此光強的NPQ, 正序RLCs步長10 s, 30 s和60 s 的NPQ在LL下分別為反序的2.86, 3.05和3.03倍, 是非序的3.21, 3.21和4.11倍; 在HL下為反序的1.64, 3.74和3.25倍, 是非序的5.74, 8.96和13.06倍。

圖2 步長和光序列對光合參數(shù)的影響 Fig. 2 Impact of light duration and sequence on the parameters of RLC

3 討論

本文設(shè)置在不同光背景馴化下, 對不同光序和步長的光曲線進行比較, 目的是探究RLC曲線中內(nèi)在光適應(yīng)是否會影響底棲甲藻的葉綠素?zé)晒獾臏y定, 進而改變RLCs的結(jié)果以及由此衍生的光合生理參數(shù)。而這些結(jié)果牽涉到兩個光適應(yīng)階段: 一是RLCs測定前的不同光背景馴化所導(dǎo)致的光適應(yīng), 也正是光曲線所測定的光適應(yīng)類型; 二是在RLC期間的光適應(yīng), 而這是RLCs技術(shù)應(yīng)當(dāng)避免的。因此, 如果假設(shè)成立, 為更好反映光背景下的光適應(yīng), 減小RLCs期間內(nèi)部光適應(yīng)是必要的。

圖3 步長和光序列對NPQ動力學(xué)曲線的影響 Fig. 3 Impact of light duration and sequence on NPQ kinetic curves

3.1 NPQ的影響因素與對光曲線的影響

NPQ是底棲光合生物重要的光保護機制之一, 同時也是對光環(huán)境適應(yīng)的必要途徑[20]?；贜PQ的特性, 是依靠光照所造成的的類囊體質(zhì)子梯度的構(gòu)建來驅(qū)動葉黃素循環(huán)進行熱能耗散。測定RLCs期間光化光的照射不可避免的誘導(dǎo)NPQ的產(chǎn)生, 而NPQ在序列內(nèi)的強弱決定了序列內(nèi)光適應(yīng)程度[21]。

NPQ的強弱受到步長和光化光序列方式影響。步長的延長會導(dǎo)致NPQ的升高, 依照最小化序列內(nèi)光適應(yīng)的原則, 步長應(yīng)盡可能的短暫, 但同時需要考慮其他的因素。步長為10 s會造成正反序RLCs的rETRmax和Ek的低估。在phyto-PAM參數(shù)設(shè)定優(yōu)化中, rETRmax和Ek基本在30 s達到穩(wěn)定, 與本文的結(jié)果基本一致[22]。此外, 在反序RLCs中使用步長10 s時, 由于前序NPQ累積和葉綠體呼吸導(dǎo)致NPQ的上升, 造成α的高估(圖2a)。因此推薦使用步長30 s進行RLCs測定。

采用非序RLCs的方式, 每個光化光的NPQ均由獨立的樣品測定, 可獲得最小NPQ強度和無序列內(nèi)光適應(yīng), 較為真實的反映光馴化下的光適應(yīng)。因此可將其結(jié)果作為標(biāo)準對正反序RLCs的結(jié)果進行比較。正序RLCs的NPQ由于連續(xù)光化光的刺激, 上升速度遠高于非序RLCs。在非序RLCs已經(jīng)達到光飽和或光抑制光強時, 正序RLCs由于已累積較高NPQ值, 使得rETR能夠繼續(xù)上升, 造成曲線的不飽和。反序RLCs的NPQ由于在高光強部分沒有前序累積, 處于較低的數(shù)值, 比如在2 064 μmol photons/(m2·s)時為正序RLCs的1/3左右。因此曲線有光飽和或光抑制的體現(xiàn), 并且在HL的30 s和60 s時幾乎與非序RLCs重合。因此, 反序RLCs在控制RLCs序列內(nèi)光適應(yīng)和反映光背景馴化的光適應(yīng)方面優(yōu)于正序RLCs。

3.2 光合生理參數(shù)對光適應(yīng)的反映

由光曲線獲得光合作用參數(shù)已經(jīng)在多種光合生物的野外和室內(nèi)研究中用于反映短期或長期的光適應(yīng)狀態(tài)[15,23]。C. tropicalis在低于500 μmol photons/(m2·s)時的α和rETRmax基本維持不變甚至呈現(xiàn)上升趨勢, 當(dāng)光強超過500光強時, α和rETRmax均呈現(xiàn)下降趨勢。α為光利用效率, 為光捕獲系統(tǒng)向光反應(yīng)中心PSII傳遞光能的比率; 而rETR和卡爾文循環(huán)有著密切的聯(lián)系, rETRmax可反映卡爾文循環(huán)的最大能力[24]。Pniewski 等[25]利用RLCs技術(shù)在底棲微藻的調(diào)查中觀察到長期適應(yīng)低光環(huán)境的細胞在高光強下α和rETRmax均下降; 而長期接觸高光環(huán)境的細胞在高光條件下rETRmax仍能夠升高。比較本研究的結(jié)果, 說明了C. tropicalis在一定光強范圍內(nèi)能夠提升卡爾文循環(huán)來加速電子的傳遞, 但過高的光強在1 h光馴化中超出最適范圍, 甚至可能存在光抑制。在反序和非序RLCs步長30 s和60 s結(jié)果中, 當(dāng)馴化光強低于500 μmol photons /(m2·s)時Ek維持不變或上升趨勢, 其值在450~650 μmol photons/(m2·s)范圍之間; 而超過500 μmol photons /(m2·s)之后呈現(xiàn)下降趨勢。Ek反映細胞的最大最適光強, 這一趨勢和數(shù)值均與上述的結(jié)論相一致。但在30 s和60 s正序RLCs中, Ek隨馴化光強升高而升高, 且其值也遠超反序和非序RLCs的結(jié)果, 存在嚴重的高估。

4 結(jié)論

普通正序RLCs在反映底棲甲藻C. tropicalis的光合狀態(tài)時, 由于測定序列內(nèi)NPQ的快速累積, 造成曲線的不飽和和光合參數(shù)Ek的高估。采用反序RLCs可減緩序列內(nèi)NPQ的累積問題, 尤其在高光化光部分。曲線結(jié)果可觀察到光飽和或光抑制, 反映光背景的光合參數(shù)趨勢也與非序RLCs的結(jié)果基本一致。在反序RLCs中, 步長10 s時對α存在高估, 而對rETRmax和Ek的低估, 在步長30 s時各項參數(shù)基本達到穩(wěn)定。在今后底棲甲藻的光合生理研究中, 如RLCs出現(xiàn)曲線不飽和現(xiàn)象, 可考慮采用30 s反序RLCs進行測定。