海洋污損細(xì)菌分離純化及金屬離子抑菌研究

夏蘇杭, 全艷玲, 周艷文, 陳東旭, 康宏偉, 呂 哲, 陳 爽, 高乙寧, 李 娜, 解生權(quán), 高 鵬

(1. 遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 表面工程研究所, 遼寧 鞍山 114051; 2. 海洋裝備用金屬材料及其應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 鞍山 114000; 3. 遼寧經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110122)

海洋生物污損給海洋產(chǎn)業(yè)、海洋工程以及海洋裝備造成了一系列不利的影響[1]。生物污損一般分為污損微生物和大型污損生物[2], 過(guò)程如下: 材料表面被一些有機(jī)物和無(wú)機(jī)物吸附, 改變材料表面特征, 如電荷的電性、親水疏水性等形成生物膜的條件, 從而形成條件膜[3]。條件膜起到了促進(jìn)細(xì)菌、微型藻類的附著的作用[4]。黏附污損微生物附著后, 不斷生長(zhǎng)繁殖, 黏附污損微生物表面分泌出胞外聚合物(EPS), EPS是大分子黏性物質(zhì), 能夠改變細(xì)胞表面的物理化學(xué)性質(zhì), 這些大分子黏性物質(zhì)對(duì)黏附污損微生物細(xì)胞之間的吸附、聚集等起有利作用[5], 最終形成一層具有一定厚度的微生物膜[2,6]。微生物膜為大型污損生物提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和良好的生長(zhǎng)環(huán)境, 它們的幼蟲(chóng)或孢子黏附在微生物膜上, 并不斷地發(fā)育生長(zhǎng), 分泌各種高強(qiáng)度黏附膠附著在物體表面, 最終發(fā)展形成大型生物污損層[7]。擬分離鑒定模擬海水環(huán)境中鍍鈷基、鎳基及含銅氧化鈦基膜的船用厚鋼板試樣片在海水中吸附的早期污損細(xì)菌[8], 研究鈷、鎳及銅金屬離子濃度對(duì)早期污損細(xì)菌的影響, 對(duì)研究一種新型防污涂層具有重要意義[9]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鋼樣: 來(lái)自海洋裝備用金屬材料及其應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鋼片基體是AH32海工鋼, 采用等離子噴涂技術(shù)處理鋼樣[10], 在鋼樣表面鍍鈷基、鎳基及含銅氧化鈦基涂層, 圓柱體鋼片直徑24 mm, 厚度8 mm。正方體鋼片邊長(zhǎng)20 mm, 厚度為5 mm。

藥品: 分離細(xì)菌采用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂、生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基試劑主要來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

儀器: HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱, JD3000-3電子天平, LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器, SW-CJ-2FD雙人單面垂直潔凈工作臺(tái), LRH-250A生化培養(yǎng)箱, BM1000數(shù)碼生物顯微鏡。

1.2 鋼片吸附早期污損細(xì)菌分離純化

將鋼樣放入250 mL錐形瓶?jī)?nèi), 倒入足以沒(méi)過(guò)鋼樣的海水, 塞緊棉塞, 放入振蕩培養(yǎng)箱內(nèi), 調(diào)節(jié)振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為25℃、振蕩頻率為120 rpm, 以此模擬海水中的溫度和振蕩頻率, 分別培養(yǎng)10、20、30、40 min、1、5、9、13、16、20、24 h, 培養(yǎng)結(jié)束后, 將錐形瓶取出, 無(wú)菌濾紙吸鋼樣表面海水, 將鋼樣放入無(wú)菌水中, 沖洗干凈吸附細(xì)菌, 菌懸液傾倒?fàn)I養(yǎng)瓊脂平板, 37℃培養(yǎng)2 d, 將培養(yǎng)好的細(xì)菌按照菌落的顏色、大小、形狀進(jìn)行分離純化[11-13]。

1.3 早期污損細(xì)菌的鑒定

將分離純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色, 糖類分解實(shí)驗(yàn), V-P實(shí)驗(yàn), 甲基紅實(shí)驗(yàn), 檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn), 硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn), 淀粉水解實(shí)驗(yàn), 吲哚實(shí)驗(yàn), 接觸酶實(shí)驗(yàn), 記錄結(jié)果[14]。

1.4 金屬離子對(duì)早期污損細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

采用濾紙片法實(shí)驗(yàn)[15], 配置不同濃度的CuSO4、CoCl2、NiCl2溶液, 確定金屬離子溶液對(duì)一株早期海洋污損細(xì)菌抑菌效果[16]。含銅氧化鈦基膜模擬海水中振蕩10 min, 分離吸附1株革蘭氏陽(yáng)性桿狀菌作為待測(cè)菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 早期污損細(xì)菌生長(zhǎng)特征

依據(jù)菌落形態(tài), 細(xì)胞形態(tài), 革蘭氏染色, 糖類分解實(shí)驗(yàn), V-P實(shí)驗(yàn), 甲基紅實(shí)驗(yàn), 檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn), 硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn), 淀粉水解實(shí)驗(yàn), 吲哚實(shí)驗(yàn), 接觸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 3種膜上分離純化出42株細(xì)菌, 經(jīng)伯杰手冊(cè)查證[17], 共分為6類: G+芽孢桿菌、G+芽孢乳桿菌、G+葡萄球菌、G+諾卡氏菌、G–假單胞菌、G+無(wú)芽孢桿菌類, 分離到代表性細(xì)菌鑒定結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表2表明, 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌最先出現(xiàn)在鋼樣上, 30 min后, 在Ni基膜發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌。應(yīng)與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān), 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸兩種單糖相互間隔連成長(zhǎng)鏈聚糖, 磷壁酸結(jié)合在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁上, 一種與肽聚糖分子進(jìn)行共價(jià)結(jié)合, 另一種是跨越肽聚糖層與細(xì)胞膜的脂質(zhì)層共價(jià)結(jié)合, 而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁厚度比革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌薄, 肽聚糖層很薄, 埋藏在外膜脂多糖(LPS)內(nèi)[18], 革蘭氏陰性細(xì)菌不含有磷壁酸。磷壁酸的主要成分甘油磷酸和核糖醇磷酸使革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞表面整體帶負(fù)電, 而鋼片中鐵離子帶正電, 利于和金屬膜結(jié)合, 故革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌先附著在金屬表面(圖2)。

表1 代表性細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab. 1 Results of physiological and biochemical identification of bacteria

2.2 Cu、Co、 Ni 3種金屬離子對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

Cu、Co、 Ni 3種金屬離子對(duì)海洋污損細(xì)菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表3、圖3。

由圖3可見(jiàn): Cu2+溶液質(zhì)量濃度為10 g/L~30 g/L, 抑菌圈的直徑慢慢變大, 當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到30 g/L時(shí), 抑菌圈的直徑達(dá)到最大, 此時(shí)的抑菌圈直徑2.8 cm, 30 g/L之后抑菌圈的直徑開(kāi)始變小, 當(dāng)質(zhì)量濃度> 50 g/L之后無(wú)抑菌圈。當(dāng)Co2+溶液濃度<60 g/L時(shí), 沒(méi)有抑菌圈, 當(dāng)質(zhì)量濃度在60 g/L~80 g/L時(shí)抑菌圈的直徑逐漸變大, 在80 g/L達(dá)到最大, 抑菌圈直徑為1.9 cm, 在80 g/L之后抑菌圈的直徑逐漸變小, 最后 趨于平穩(wěn)。當(dāng)Ni2+溶液質(zhì)量濃度<70 g/L時(shí), 抑菌圈的直徑為0, 當(dāng)濃度>70 g/L時(shí), 開(kāi)始出現(xiàn)抑菌圈, 質(zhì)量濃度110 g/L時(shí), 抑菌圈直徑達(dá)到最大, 抑菌圈直徑為1.3 cm, 當(dāng)質(zhì)量濃度>110 g/L后抑菌圈消失。

圖1 代表性細(xì)菌形態(tài) Fig. 1 Representative bacterial morphology

表2 早期鋼樣污損細(xì)菌 Tab. 2 Early steel stain bacteria

續(xù)表

圖2 細(xì)菌吸附機(jī)制圖 Fig. 2 Diagram of bacterial adsorption mechanism

表3 3種離子抑菌圈 Tab. 3 Three kinds of ionic bacteriostatic circles

圖3 3種金屬離子抑菌圈趨勢(shì)圖 Fig. 3 Trends in the bacteriostasis circles of three metalions

3 結(jié)論

分離純化出早期海洋污損細(xì)菌, 依據(jù)伯杰手冊(cè)第八版, 10 min~20 min, 吸附細(xì)菌為G+芽孢桿菌屬、G+芽孢乳桿菌屬、G+無(wú)芽孢桿菌中乳桿菌、G+葡萄球菌屬、G+無(wú)芽孢絲狀菌。30分鐘, 出現(xiàn)G–假單胞菌屬、G+無(wú)芽孢利斯特菌屬, 1 h芽孢桿菌出現(xiàn)莢膜, 9 h后莢膜加厚。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中磷壁酸攜帶負(fù)電荷, 與金屬離子所攜帶的正電荷相結(jié)合, 率先附著在金屬表面, G+細(xì)菌表面的磷壁酸更容易與金屬離子吸附。Co基膜在10 min~9 h之間對(duì)細(xì)菌的抑制能力逐步降低, 到9 h時(shí)對(duì)細(xì)菌的抑制力最弱, 9 h之后抑制能力逐步增強(qiáng)。Ni基膜在10 min~5 h之間對(duì)細(xì)菌的抑制能力逐步減小, 到5 h時(shí)抑制能力最弱, 5 h~ 9 h之間細(xì)菌的抑制能力基本不變, 9 h~16 h抑制能力逐步提高, 16 h之后抑制能力變開(kāi)始變強(qiáng)。TiO2基膜在10 min~5 h之間對(duì)細(xì)菌的抑制能力逐步減弱, 5 h~9 h細(xì)菌的抑制能力保持不變, 9 h~16 h抑制能力增加, 16 h之后對(duì)細(xì)菌的抑制能力再次減弱。24 h抑制污損細(xì)菌生長(zhǎng)能力監(jiān)測(cè), Ni基膜>TiO2基膜>Co基膜。Cu2+溶液達(dá)到30 g/L時(shí), Co2+溶液濃度在80 g/L, Ni2+溶液濃度110 g/L時(shí), 抑菌圈直徑分別達(dá)到最大, 相同濃度下銅離子對(duì)污損細(xì)菌影響顯著。