NaCl和NaHCO3混合鹽脅迫對馬藺幼苗生理特性的影響

袁澤斌，牟昌紅，王波，孫向麗,2,3*

(1.蘇州大學(xué) 建筑學(xué)院風(fēng)景園林系，江蘇 蘇州 215123； 2.蘇州市建筑與城市環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué) 蘇州園科集團(tuán)建筑與城市環(huán)境協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215123)

鹽堿土在我國分布廣泛，嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。我國耕地鹽堿化面積超過760萬hm2，占總耕地面積的1/5，主要分布在東北、華北及西北內(nèi)陸地區(qū)[1]。鹽堿土中的離子會抑制植物對養(yǎng)分的吸收[2]，還會提高土壤中重金屬的遷移能力[3]。采用植物改良的方式雖周期較長，卻能從根本上改善土壤理化性質(zhì)，同時(shí)還能產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益，被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)持久的方法[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物馬藺的種子由江蘇省沭陽斗研種業(yè)有限公司提供。選取籽實(shí)飽滿，種皮完好的馬藺種子，在50 ℃以下的溫水中浸種3 d，期間每天更換水2～3次，最后1次換水時(shí)把生根粉倒進(jìn)去一起浸泡10 min，撈出晾干，然后播種在盛有石英砂和泥炭的基質(zhì)中，覆蓋薄膜，每3 d澆1次水，保持基質(zhì)處于濕潤狀態(tài)，待幼苗長至10 cm時(shí)，移栽至直徑10 cm的小花盆中，并用鹽溶液處理，每個(gè)小花盆中盛100 g基質(zhì)。

1.2 方法

1.2.1 幼苗的處理方法

試驗(yàn)于2019年3—4月在蘇州大學(xué)建筑學(xué)院栽培生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將栽有馬藺幼苗的小花盆放置在規(guī)格相同的白色托盤中，每個(gè)托盤中放置相同數(shù)量的馬藺幼苗，以清水處理為空白對照，其余5個(gè)處理分別為0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3、0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3五種鹽溶液組合(所有濃度均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，分別將配制好的鹽溶液以每盆100 mL倒入托盤中，讓馬藺幼苗充分吸收鹽溶液，直至完全吸收。試驗(yàn)過程中，每7 d取1次樣，并給幼苗澆1次水，每處理幼苗80棵，為減小試驗(yàn)誤差，每次取樣時(shí)隨機(jī)選取15棵剪取幼苗葉片，每5棵為1個(gè)重復(fù)，每處理3個(gè)重復(fù)，共取樣5次，每次取樣完后剪取了葉片的幼苗棄用。

1.2.2 生理特性指標(biāo)測定

SPAD值的測定采用SPAD-502葉綠素儀，Pro含量測定采用磺基水楊酸比色法，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法，SOD、POD、CAT酶活性的測定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與圖表的繪制，SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合鹽脅迫對馬藺幼苗葉片SPAD值的影響

SPAD值(綠色度)與葉子的葉綠素含量呈顯著正相關(guān)，可對葉片中的葉綠素水平提供可靠估計(jì)[9]。表1顯示，通過對鹽脅迫后的馬藺幼苗葉片的SPAD值的測定表明，在脅迫第7天時(shí)，各處理的幼苗葉片葉綠素含量未出現(xiàn)顯著差異。隨著脅迫時(shí)間的延長，對照處理的幼苗葉片葉綠素含量呈顯著遞增趨勢，而其他處理均為先增長后降低。在脅迫第21天時(shí)，除對照外，其余各處理的幼苗葉片葉綠素含量達(dá)到最大，而后呈下降趨勢。在脅迫第35天時(shí)，各處理葉綠素含量與對照相比均顯著降低，其中含量最低的為0.10% NaCl+0.20% NaHCO3處理的幼苗葉片，僅為28.90，較對照降低29.73%；其次為0.30%NaHCO3處理的幼苗葉片，為29.50，較對照降低28.28%；混合鹽中NaHCO3濃度越大，幼苗葉片中的葉綠素含量越低。

表1 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片SPAD值的影響

注：同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。表2～3同。

2.2 混合鹽脅迫對馬藺幼苗Pro含量的影響

Pro積累與脅迫耐受性有關(guān)[10-11]。Pro被認(rèn)為是一種滲透調(diào)節(jié)劑，可保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激造成的損傷[12-13]。通過對鹽脅迫后不同時(shí)間馬藺幼苗葉片中Pro含量的測定(表2)表明，空白對照組的馬藺幼苗葉片中的Pro含量變化較穩(wěn)定，其余各處理隨著脅迫時(shí)間的延長均呈先增長后下降的趨勢。在處理的第7天，經(jīng)0.3% NaHCO3溶液處理的幼苗葉片中Pro含量較其他處理已顯著上升，達(dá)到5.04 μg·g-1；第21天時(shí)含量達(dá)到最大，為7.34 μg·g-1，為空白對照的1.70倍；在第35天時(shí)，經(jīng)0.30% NaCl和0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理的幼苗葉片中的Pro含量較對照顯著下降，0.15% NaCl+0.15% NaHCO3、0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理中Pro含量仍顯著高于對照組。

表2 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片Pro含量的影響

2.3 混合鹽脅迫對馬藺幼苗可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其增加和積累能夠提高植物細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，也是篩選抗逆性的指標(biāo)之一[14]。通過對鹽溶液脅迫后不同時(shí)間馬藺幼苗葉片中可溶性蛋白含量的測定(表3)表明，隨著脅迫時(shí)間的延長，CK處理的可溶性蛋白含量較穩(wěn)定，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理幼苗葉片中的可溶性蛋白含量表現(xiàn)出“下降、上升”的趨勢，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理則表現(xiàn)為“下降、上升、下降”的趨勢。在脅迫的第7天，可溶性蛋白含量最低的為0.30% NaHCO3處理，僅為0.238 mg·g-1，較0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理顯著下降；第21天時(shí)，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的可溶性蛋白含量較其他處理顯著升高，分別達(dá)到0.273和0.285 mg·g-1；第35天時(shí)，可溶性蛋白含量最高的為0.30% NaCl處理的幼苗葉片，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理較其他處理顯著降低，推測原因可能是這兩個(gè)處理對幼苗的脅迫作用較強(qiáng)，導(dǎo)致可溶性蛋白逐漸降解。

表3 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

2.4 混合鹽脅迫對馬藺幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

2.4.1 SOD酶活性

植物的抗氧化酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)等多種酶類，是植物在遭受逆境脅迫時(shí)重要的防御體系[15]。各酶活性之間的平衡可將超氧自由基和H2O2維持在穩(wěn)定水平[16]。SOD是抗氧化酶系統(tǒng)中的第一道防線[17]，其作用是保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物誘導(dǎo)的氧化脅迫[18]。通過對鹽脅迫后不同時(shí)間馬藺幼苗葉片中SOD活性的測定(圖1)表明，經(jīng)各鹽脅迫處理的幼苗葉片中的SOD的活性均始終高于空白對照組，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理隨著脅迫時(shí)間的延長總體上呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢。在第35天時(shí)，SOD活性分別為第7天的1.72、1.56、1.70倍；在第28天時(shí)，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的SOD活性達(dá)到最大，其中0.30% NaHCO3處理的活性達(dá)到1 455.25 U·g-1，為對照的1.73倍；到第35天出現(xiàn)略微下降，說明在鹽脅迫的過程中，馬藺幼苗可通過提高SOD的活性來保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物的影響。

圖1 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片SOD酶活性的影響

2.4.2 CAT酶活性

CAT廣泛存在于植物中，是一種包含血紅素的4聚體酶，在遭受逆境脅迫時(shí)，CAT主要負(fù)責(zé)清除光呼吸和脂肪酸β氧化過程產(chǎn)生的H2O2[19]。通過對鹽脅迫后的馬藺幼苗葉片中CAT活性的測定(圖2)表明，除空白對照組外，各處理幼苗葉片中的CAT酶活性都呈現(xiàn)出“上升、下降”的趨勢。其中，0.30%NaCl、0.20%NaCl+0.10%NaHCO3、0.15%NaCl+0.15%NaHCO3處理的CAT酶活性在脅迫第21天時(shí)達(dá)到最大，CAT活性最低的為0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的CAT活性在脅迫第28天時(shí)達(dá)到最大，其中0.30% NaHCO3處理的酶活性達(dá)到380.97 U·g-1，為對照的1.31倍；在第35天時(shí)，各處理的CAT酶活性均較對照小，可能原因是在脅迫初始階段，幼苗體內(nèi)產(chǎn)生過多的H2O2，CAT活性不斷升高以清除H2O2來維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，隨著脅迫時(shí)間的延長，H2O2不斷積累，毒害植物細(xì)胞，致使CAT活性出現(xiàn)急劇下降。

圖2 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片CAT活性的影響

2.4.3 POD酶活性

POD可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用[20]。通過對鹽脅迫后不同時(shí)間馬藺幼苗葉片中POD活性的測定(圖3)表明，在脅迫初期，各處理幼苗葉片中的POD活性均呈現(xiàn)出略微下降的趨勢；在第21天時(shí)，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理的POD活性急劇升高，最高的為0.30% NaCl處理，達(dá)到3 666.67 U·g-1，為空白對照組的2.00倍，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理在第28天時(shí)酶活性達(dá)到最大，分別為空白對照組的1.73和1.88倍；在第35天時(shí)，除0.10% NaCl+0.20% NaHCO3處理的POD活性較對照略高外，其余處理已降至低于空白對照的水平，原因可能為在初始階段，由于CAT活性的升高及在清除H2O2的過程中起到主導(dǎo)作用，隨著H2O2的不斷積累，CAT的作用有限，POD活性開始升高，與CAT共同作用以清除細(xì)胞中的H2O2等有毒有害物質(zhì)，最終由于鹽脅迫作用的持續(xù)，導(dǎo)致POD活性也出現(xiàn)下降趨勢。

圖3 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片POD活性的影響

3 討論

植物耐鹽的生理機(jī)制包括逃避鹽害和忍受鹽害兩種方式，滲透調(diào)節(jié)以及在抗氧化酶系統(tǒng)下參與的膜系統(tǒng)的保護(hù)，都屬于忍受鹽害的方式[21]。在鹽堿脅迫下，植物可以通過合成Pro、可溶性蛋白、醇類等有機(jī)調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡，這些物質(zhì)還能起到穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中酶分子活性構(gòu)象的作用[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，燕麥[24]、小麥[25]、玉米[26]等農(nóng)作物在遭受鹽脅迫時(shí)可積累Pro和可溶性蛋白來維持正常的生命活動。本研究也發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫過程中，Pro和可溶性蛋白含量會有所提高，但隨著脅迫時(shí)間的延長，Pro含量在脅迫后期有所下降，這與張明軒等[27-28]在研究NaCl對馬藺幼苗生長的影響時(shí)所得出的結(jié)論相同。SPAD值可反映葉片中葉綠素的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫時(shí)間內(nèi)，葉片中的葉綠素含量呈先升后降的趨勢，這與劉文瑜等[29-30]在藜麥、樸樹和速生榆上的研究結(jié)果一致。植物耐鹽的生理機(jī)制是不同作用之間相互協(xié)作的，抗氧化酶的保護(hù)作用可與滲透調(diào)節(jié)同時(shí)存在。本研究中，馬藺幼苗在鹽脅迫作用下SOD活性會不斷升高，CAT活性會隨著SOD作用不斷產(chǎn)生H2O2而升高，POD的活性則會在CAT清除H2O2能力不足時(shí)升高。馬晶晶[21]在研究NaCl鹽脅迫對馬藺幼苗生長的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，SOD的活性是先降后升的，原因可能是，其處理幼苗所用NaCl濃度為1.5%，為本研究的5倍，在高鹽脅迫下所表現(xiàn)出的酶活性變化和低鹽脅迫下有所差異。

本研究通過用單鹽和混合鹽對馬藺幼苗進(jìn)行脅迫發(fā)現(xiàn)，單鹽的脅迫作用總體上較混合鹽的脅迫作用強(qiáng)，且堿性鹽的脅迫作用較中性鹽脅迫作用強(qiáng)。白文波等[31]在研究NaCl和NaHCO3脅迫下馬藺生長與光合特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，堿性鹽特有的高pH會導(dǎo)致植物體內(nèi)的生理代謝紊亂，也證明堿性鹽脅迫強(qiáng)于中性鹽。劉丹等[32]發(fā)現(xiàn)，單鹽對狗棗獼猴桃幼苗的脅迫作用強(qiáng)于混合鹽，這與本研究結(jié)論一致，但其研究結(jié)果卻認(rèn)為，NaCl脅迫作用強(qiáng)于NaHCO3，原因可能為狗棗獼猴桃為大型藤本植物，對NaCl和NaHCO3的響應(yīng)機(jī)制不同。

本研究對馬藺幼苗的耐鹽機(jī)制做了生理上的初步探究，馬藺耐鹽基因值得深入研究。本研究采用的為基質(zhì)培養(yǎng)幼苗，澆灌鹽溶液的方式模擬鹽堿土，與真正的鹽堿土環(huán)境存在著一定的差別，所以在今后的研究中也要注重在實(shí)際中的應(yīng)用，為馬藺在鹽堿土改良方面的推廣提供可靠的依據(jù)。

綜上所述，通過本研究得出，在脅迫35 d中，各鹽溶液處理后的馬藺幼苗葉片的SPAD值和Pro含量均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其中經(jīng)0.10% NaCl+0.20% NaHCO3和0.30%NaHCO3溶液處理的幼苗葉片的SPAD值在第35天時(shí)下降最顯著；在第21天時(shí)，Pro的含量在5個(gè)處理中也最多，這兩個(gè)處理的幼苗葉片中的可溶性蛋白的變化趨勢與其他處理也不完全相同，表現(xiàn)為“下降、上升、下降”的趨勢，而其余處理則為“下降、上升”；5個(gè)處理對抗氧化酶系統(tǒng)中的各種酶活性的影響也存在較大的差別，在脅迫期內(nèi)，SOD活性總體呈上升趨勢，僅0.10% NaCl+0.20% NaHCO3和0.30%NaHCO3處理的幼苗葉片中SOD活性在第35天時(shí)出現(xiàn)略微下降，CAT和POD活性的變化趨勢則大體相同。由此可得，在單鹽中，堿性鹽的脅迫作用較中性鹽的脅迫作用強(qiáng)；混合鹽溶液中，堿性鹽的濃度越大，脅迫就越嚴(yán)重，除0.10% NaCl+0.20% NaHCO3鹽溶液組合外，單鹽的脅迫作用較另外兩個(gè)鹽溶液組合強(qiáng)。