地萸補(bǔ)腎固沖方對(duì)未成年雌性大鼠卵巢組織中FSHR和LHR的影響*

劉方洲，張雪俠，郭曉燕，李士瑾

(河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州450004)

青春期功血屬無(wú)排卵性功血，屬子宮異常出血的范疇[1],雖有成批的卵泡形成，卻無(wú)排卵出現(xiàn)，進(jìn)而引起子宮的異常出血[2]。青春期功血大多發(fā)生在少女初潮的前兩年，無(wú)排卵型及無(wú)黃體形成者占55%～75%[3]，其中無(wú)排卵性青春期功血在發(fā)生初期癥狀就比較嚴(yán)重。目前，青春期功血是一個(gè)較難徹底治愈的婦科疾病。地萸補(bǔ)腎固沖方是臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黨參、炒白術(shù)、生白芍、菟絲子、生山藥、旱蓮草、淫羊藿、山萸肉、川續(xù)斷、阿膠(烊化)、生地黃、雞內(nèi)金、熟地黃組成，對(duì)性腺軸具有調(diào)節(jié)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察了地萸補(bǔ)腎固沖方對(duì)未成年雌性大鼠卵巢組織中促卵泡生成素受體(FSHR)和黃體生成素受體(LHR)的影響，以期對(duì)其的作用機(jī)制進(jìn)行更深一步的探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)未成年雌性Wistar大鼠50只，21 d齡，體質(zhì)量50～70 g，由山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供,合格證號(hào)為37009200005897，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)為SYXK(豫)2012-0009。

1.2 藥品、試劑與儀器

地萸補(bǔ)腎固沖方組成：黨參15 g，炒白術(shù)15 g，生白芍15 g，菟絲子20 g，淫羊藿20 g，生山藥30 g，旱蓮草20 g，山萸肉15 g，川續(xù)斷12 g，阿膠(烊化)12 g，生地黃6 g，雞內(nèi)金9 g，熟地黃20 g。藥液由河南省中醫(yī)藥研究院制劑室制備。將藥材按照1∶2與去離子水混合，靜置浸泡，然后倒入高壓提取罐內(nèi)進(jìn)行提取，濃縮為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5 g/mL溶液，高溫消毒，置于4 ℃冰箱保存，用時(shí)臨時(shí)配制合適的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。己烯雌酚片，0.5 mg/片，合肥久聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20181013；水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20180922；促卵泡生成素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(TT)、游離睪酮(FT)、促性腺激素釋放激素(GnRH)ELISA試劑盒，均購(gòu)自蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號(hào)E20181225A；促卵泡生成素受體(FSHR)和黃體生成素受體(LHR)免疫組化試劑盒，購(gòu)自武漢博歐特生物科技有限公司，批號(hào)20190122；9 g/L氯化鈉注射液，四川科倫藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品,批號(hào)C119011104-1；去離子水，河南省奧林特藥廠提供。JSB30-1電子天平,上海浦春劑量?jī)x器有限公司產(chǎn)品；LD4-2A離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品；SYNERGY NEO多功能微孔板檢測(cè)儀，BioTek Instruments,Inc產(chǎn)品；CX31型奧林巴斯顯微鏡，產(chǎn)地日本；10 mL一次性使用無(wú)菌注射器，上海康德萊企業(yè)發(fā)展集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，己烯雌酚組，地萸補(bǔ)腎固沖方高、中、低劑量組5組，每組10只。正常對(duì)照組給予生理鹽水灌胃；己烯雌酚組給予己烯雌酚混懸液0.067μg/g (按臨床劑量的6.7倍) 灌胃；地萸補(bǔ)腎固沖方高、中、低劑量組分別給地萸補(bǔ)腎固沖方浸膏稀釋液30，15，7.5 g/kg(以生藥量計(jì)) 灌胃，分別相當(dāng)于臨床劑量的6.7，3.35，1.68倍。各組均按20 μL/g給藥，1 d 1次，連續(xù)給藥4周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

末次給藥后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/L的水合氯醛麻醉，取血、卵巢以備用。

1.4.1 血清中E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平

采用ELISA法檢測(cè)。將大鼠血液在4 ℃下以3 000 r/min 離心10 min分離出血清，檢測(cè)血清中E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.2 卵巢組織中FSHR、LHR的表達(dá)

采用免疫組化法檢測(cè)。稱量卵巢質(zhì)量，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L的多聚甲醛固定，常規(guī)制片，厚約5 mm，進(jìn)行免疫組化染色程序后封片，運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行定量分析卵巢組織中FSHR、LHR的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平

與正常對(duì)照組對(duì)比，己烯雌酚組中大鼠血清的E2、LH、FSH、P、GnRH含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地萸補(bǔ)腎固沖方高劑量組中血清的E2、P、LH含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地萸補(bǔ)腎固沖方中、低劑量組血清的各項(xiàng)指標(biāo)有升高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 )。結(jié)果表明：地萸補(bǔ)腎固沖方可以在一定程度上調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)的激素水平。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平對(duì)比

組 別nE2LHTTFSH正常對(duì)照組104.46±1.762.51±1.811.33±0.431.64±0.54己烯雌酚組96.03±1.19?3.70±0.45?1.95±1.022.63±0.62?地萸補(bǔ)腎固沖方高劑量組106.12±1.14?3.66±0.74?1.41±0.442.20±0.88地萸補(bǔ)腎固沖方中劑量組95.21±0.812.76±0.531.30±0.321.97±0.31地萸補(bǔ)腎固沖方低劑量組94.80±0.602.92±0.441.01±0.541.82±0.44組 別nPFTGnRH正常對(duì)照組102.49±0.480.12±0.0520.60±1.08己烯雌酚組93.29±0.97?0.19±0.1323.05±2.62?地萸補(bǔ)腎固沖方高劑量組103.11±0.57?0.19±0.2421.20±0.77地萸補(bǔ)腎固沖方中劑量組92.56±0.560.20±0.3221.43±1.08地萸補(bǔ)腎固沖方低劑量組92.69±0.430.12±0.0721.32±0.74

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05。己烯雌酚組，地萸補(bǔ)腎固沖方中、低劑量組各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

2.2 各組大鼠卵巢組織中FSHR表達(dá)對(duì)比

光鏡下，可見(jiàn)FSHR蛋白不同程度地表達(dá)于正常對(duì)照組、己烯雌酚組、地萸補(bǔ)腎固沖方高、中、低劑量組卵巢的顆粒細(xì)胞中。見(jiàn)圖1。

正常對(duì)照組：卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，顆粒細(xì)胞中可見(jiàn)大量的棕黃色顆粒的表達(dá)

己烯雌酚組：卵巢的顆粒細(xì)胞中有大量的棕黃色顆粒的表達(dá)

地萸補(bǔ)腎固沖方高劑量組：卵巢的顆粒細(xì)胞中有大量的棕黃色顆粒的表達(dá)

地萸補(bǔ)腎固沖方中劑量組：卵巢的顆粒細(xì)胞中有大量的棕黃色顆粒的表達(dá)

地萸補(bǔ)腎固沖方低劑量組：卵巢的顆粒細(xì)胞中有少量棕黃色顆粒的表達(dá)

圖像分析結(jié)果顯示：正常對(duì)照組卵巢組織中FSHR蛋白表達(dá)程度顯著低于己烯雌酚組、地萸補(bǔ)腎固沖方高劑量組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。地萸補(bǔ)腎固沖方中、低劑量組中FSHR蛋白表達(dá)不同程度地高于正常對(duì)照組，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

組 別nFSHR正常對(duì)照組105.405±0.771己烯雌酚組910.325±2.887?地萸補(bǔ)腎固沖方高劑量組109.134±2.752?地萸補(bǔ)腎固沖方中劑量組96.145±1.347地萸補(bǔ)腎固沖方低劑量組95.684±1.769

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05。己烯雌酚組，地萸補(bǔ)腎固沖方中、低劑量組各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

2.3 各組大鼠卵巢組織中LHR表達(dá)對(duì)比

光鏡下，可見(jiàn)LHR蛋白不同程度地表達(dá)于正常對(duì)照組，己烯雌酚組，地萸補(bǔ)腎固沖方高、中、低劑量組卵巢的卵泡膜細(xì)胞中。見(jiàn)圖2。

正常對(duì)照組：卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，卵泡膜細(xì)胞中存在大量的棕黃色顆粒的表達(dá)

己烯雌酚組：卵巢的卵泡膜細(xì)胞中可見(jiàn)大量的棕黃色顆粒

地萸補(bǔ)腎固沖方高劑量組：卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，卵泡膜細(xì)胞中存在大量的棕黃色顆粒的表達(dá)

地萸補(bǔ)腎固沖方中劑量組：卵巢組織結(jié)構(gòu)完整、卵泡膜細(xì)胞中存在大量的棕黃色顆粒的表達(dá)

地萸補(bǔ)腎固沖方低劑量組：卵巢的卵泡膜細(xì)胞中存在少量的棕黃色顆粒的表達(dá)

圖像分析結(jié)果顯示：正常對(duì)照組卵巢組織LHR蛋白表達(dá)顯著低于己烯雌酚組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);地萸補(bǔ)腎固沖方高、中劑量組卵巢組織LHR表達(dá)不同程度地高于正常對(duì)照組，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

組 別nLHR正常對(duì)照組104.598±1.334己烯雌酚組98.335±1.205?地萸補(bǔ)腎固沖方高劑量組105.558±2.249地萸補(bǔ)腎固沖方中劑量組94.834±1.906地萸補(bǔ)腎固沖方低劑量組94.331±1.522

注：與正常對(duì)照組比：*P<0.05。乙烯雌酚組，地萸補(bǔ)腎固沖中、低劑量組各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

3 討 論

對(duì)于青春期功血，西醫(yī)學(xué)大多采用促排卵藥物治療，但使用促排卵藥物的女性發(fā)生交界性卵巢腫瘤的可能性是未用藥女性的4倍[5]。有研究[6]表明：補(bǔ)腎中藥對(duì)青春期功血患者血清中激素的水平具有較好的調(diào)節(jié)作用，對(duì)月經(jīng)正常周期的恢復(fù)有促進(jìn)作用。也有研究表明，無(wú)排卵型功血子宮內(nèi)膜具有高水平的雌激素受體[7]，通過(guò)促進(jìn)子宮局部子宮組織雌激素受體(ER)mRNA和孕激素受體(PR)mRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)異常子宮出血的止血目的[8]。FSHR和LHR是卵巢顆粒細(xì)胞膜表面的重要受體，2者能夠分別與卵泡刺激素和黃體生成素結(jié)合，促進(jìn)卵泡的發(fā)育與排出，兩者的表達(dá)水平與細(xì)胞的成熟程度呈現(xiàn)正相關(guān)[9]。這也就意味著可以通過(guò)藥物促進(jìn)這兩個(gè)受體與相應(yīng)激素結(jié)合以促進(jìn)卵巢的發(fā)育，從而達(dá)到治療青春期功血的目的。中藥對(duì)雌激素、孕激素及其受體，以及子宮內(nèi)膜血管生成及修復(fù)都有一定的影響。王慧穎等[10]的研究表明,宮血飲能夠降低無(wú)排卵型功血患者子宮內(nèi)膜的ER及PR，但對(duì)E2水平影響不大。張樹(shù)成等[11]的研究表明,補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)中藥能明顯增強(qiáng)子宮組織的血管生成。付靈梅等[12]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明具有益氣化瘀作用的環(huán)血寧湯對(duì)置銅宮內(nèi)節(jié)育器家兔子宮內(nèi)膜的損傷有一定的修復(fù)作用，提示環(huán)血寧可能通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)而起到治療置宮內(nèi)節(jié)育器后子宮異常出血的作用。

地萸補(bǔ)腎固沖方中熟地黃、阿膠、山萸肉為君藥，有補(bǔ)腎益精、固沖止血的效果；黨參、生山藥、炒白術(shù)、川續(xù)斷、菟絲子、淫羊藿和旱蓮草為臣藥，助君藥補(bǔ)腎填精止血[13-19]；生白芍[20]、生地黃為佐藥，生白芍能養(yǎng)血和營(yíng)，助熟地黃滋養(yǎng)心肝；雞內(nèi)金為使藥，使全方滋補(bǔ)而不刺激胃，補(bǔ)而不滯，又有化瘀之功。全方體現(xiàn)出了塞流與澄源并用、固本及治標(biāo)相結(jié)合的特點(diǎn)，固攝止血的同時(shí)又兼顧活血，使血止而不留瘀。該方在補(bǔ)腎的同時(shí)又兼顧到脾肝，補(bǔ)腎健脾柔肝，使腎精充盛，天癸成熟，這也是該方的一大特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)顯示：地萸補(bǔ)腎固沖方對(duì)性激素有一定的調(diào)節(jié)作用，對(duì)卵巢組織FSHR、LHR的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，故而推測(cè)其對(duì)青春期功血的調(diào)節(jié)作用可能與其調(diào)節(jié)卵巢組織的FSHR、LHR有關(guān)。

綜上所述，地萸補(bǔ)腎固沖方從補(bǔ)腎固沖出發(fā)，通過(guò)促進(jìn)未成年雌性大鼠卵巢中FSHR、LHR的表達(dá)，使FSH、LH作用增強(qiáng)。FSH可刺激卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，LH可促進(jìn)排卵，從而促進(jìn)未成年雌性幼鼠性腺軸發(fā)育，達(dá)到治療青春期功血的作用。本研究從地萸補(bǔ)腎固沖方對(duì)卵巢組織相關(guān)蛋白的影響入手，探索其藥理藥效基礎(chǔ)研究，為青春期功血的治療提供一種新的思路與方法。