乙型肝炎患者e抗原轉(zhuǎn)換與外周血γδT和Tc17的關(guān)系1

尹凌凡，王夢(mèng)潔，熊建輝，孫黎輝

(深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院/北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518111)

乙型病毒性肝炎是一種世界性的傳染病，其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，病變主要由細(xì)胞免疫異常所致，與體內(nèi)多種免疫細(xì)胞的相互作用有關(guān)。在病毒清除和肝臟的炎性反應(yīng)中，乙型肝炎病毒(HBV)特異性T淋巴細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，而CD8+T淋巴細(xì)胞在控制HBV復(fù)制和免疫介導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮重要作用[1]。其中，γδT和細(xì)胞毒性T細(xì)胞17(Tc17)細(xì)胞群在乙型肝炎的發(fā)病、轉(zhuǎn)歸和治療中起到的作用，在近年來(lái)逐漸引起重視。乙型病毒性肝炎的治療，目前主要通過(guò)抑制病毒復(fù)制和改變機(jī)體免疫狀態(tài)2個(gè)方面來(lái)進(jìn)行[2]。機(jī)體免疫細(xì)胞的免疫狀態(tài)對(duì)于慢性乙型肝炎e抗原(HBeAg)轉(zhuǎn)換方向及預(yù)后有很大的影響,HBeAg是HBV在體內(nèi)活躍復(fù)制的標(biāo)志之一，HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換標(biāo)志病毒復(fù)制減少，免疫耐受性減弱或病變靜息等變化[3]。本研究通過(guò)觀察慢性乙型肝炎患者外周血γδT和Tc等細(xì)胞群免疫指標(biāo)與HBeAg轉(zhuǎn)換之間的關(guān)系，來(lái)了解慢性乙型肝炎患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)及在疾病轉(zhuǎn)歸方面的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月至2018年4月90例在本院肝病門(mén)診就診的乙型肝炎患者作為研究組，選取同期體檢的30例健康者作為對(duì)照組。研究組患者中男47例，女43例，年齡26～61歲，平均年齡為(45.7±5.6)歲。對(duì)照組中男16例，女14例，年齡25～60歲，平均年齡(45.9±5.1)歲。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。2組研究對(duì)象自愿參與本研究，并同意對(duì)其進(jìn)行隨訪。研究組納入、排除標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡在18歲以上，臨床診斷均符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病分會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]，既往乙型肝炎病史或HBsAg陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月，現(xiàn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV-DNA陽(yáng)性，HBeAg為持續(xù)陰性或陽(yáng)性，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)持續(xù)或反復(fù)異常或肝組織學(xué)檢查有肝炎病變；同時(shí)排除合并其他類型的病毒性肝炎、HIV感染、酒精性肝病、自身免疫性疾病等，無(wú)既往病史。健康對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)糖尿病、結(jié)核病、自身免疫性疾病和近期感染史;無(wú)肝炎癥狀和體征，血壓正常，心肺功能正常；HBsAg陰性，抗丙型肝炎病毒(HCV)陰性。研究組亞組分析： 乙型肝炎患者HBeAg轉(zhuǎn)換，即HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換定義為HBeAg轉(zhuǎn)陰且HBeAb轉(zhuǎn)陽(yáng)[2]。進(jìn)一步將研究組根據(jù)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換情況分為3組：HBeAg+/Ab-組(n=30)，即未出現(xiàn)e抗原轉(zhuǎn)換者；HBeAg+/Ab+組(n=30)，即處于轉(zhuǎn)歸中間態(tài)者；HBeAg-/Ab+組，即e抗原轉(zhuǎn)換者(n=30)。

1.2主要試劑材料 APC-γδT抗體、APC-H7-CD3抗體、PerCP-Cy5-CD8抗體、PE-IL17抗體、FITC-IFN-γ抗體、FITC-CD4抗體、PE-CD4抗體、PE-CD25抗體、AF647-CD127抗體、刺激劑BD Golgiplug及相匹配的對(duì)照抗體均購(gòu)自BD Pharmigen 公司。流式細(xì)胞儀BD FACS Canto Ⅱ購(gòu)自美國(guó)BD公司。全自動(dòng)生化分析儀貝克曼AU5800購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、染色和流式分析 所有受試者空腹8 h以上，次日清晨抽取外周靜脈血分別注入無(wú)菌普通管和肝素抗凝管，普通管靜脈血半個(gè)小時(shí)內(nèi)離心(3 600 r/min,10 min,25 ℃)取上清，PCR方法檢測(cè)血清內(nèi)HBV-DNA含量。取2 mL肝素抗凝全血與2 mL PBS混合，緩緩注入裝有2 mL Ficol分離液的試管中，進(jìn)行密度梯度離心(2 000 r/min,20 min,20 ℃)，吸取單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞加入10 mL PBS充分洗滌(1 500 r/min,5 min,20 ℃),用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)水平為2×109/L。在培養(yǎng)基中加入BD刺激劑4 μL/管，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)6 h。刺激后的PBMCs 重懸成15 μL反應(yīng)體系，加入APC-H7-CD3 抗體2.5 μL、PerCP-Cy5-CD8抗體 8 μL、APC-γδT抗體 5 μL，經(jīng)胞外染色、破膜，以50 μL反應(yīng)體系加入PE-IL17抗體10 μL、FITC-IFN-γ抗體1 μL進(jìn)行胞內(nèi)染色，后在流式細(xì)胞儀(BD FACS CantoⅡ)上對(duì)γδT細(xì)胞、IL-17+γδT細(xì)胞、IFN-γ+γδT細(xì)胞、IL-17+CD8細(xì)胞等進(jìn)行分析。

1.4血清ALT水平檢測(cè) 所有受試者空腹8 h以上，次日清晨采集靜脈血約10 mL，采用貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑檢測(cè)受試者血清ALT水平。ALT水平正常值為<40 U/L；反之則提示ALT異常。

2 結(jié) 果

2.1研究組和對(duì)照組PBMCs中IFN-γ+γδT細(xì)胞、IL-17+γδT細(xì)胞、IL-17+CD8細(xì)胞及γδT細(xì)胞水平對(duì)比 研究組IFN-γ+γδT細(xì)胞、γδT細(xì)胞水平、IL-17+CD8細(xì)胞要明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而IL-17+γδT細(xì)胞與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 研究組和對(duì)照組的γδT細(xì)胞及其亞群的對(duì)比結(jié)果

2.2慢性乙型肝炎患者HBeAg/Ab不同表達(dá)組PBMCs內(nèi)IFN-γ+γδT細(xì)胞、 IL17+γδT細(xì)胞、IL-17+CD8細(xì)胞及γδT細(xì)胞水平對(duì)比 單因素方差分析結(jié)果顯示，IFN-γ+γδT細(xì)胞、IL-17+CD8細(xì)胞、γδT細(xì)胞3個(gè)指標(biāo)整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，研究組中，HBeAg+/Ab-組和HBeAg+/Ab+組患者PBMCs內(nèi)總γδT細(xì)胞水平要顯著高于HBeAg-/Ab+組(P<0.05)，而在HBeAg+/Ab+和 HBeAg+/Ab-組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HBeAg+/Ab+組乙型肝炎患者IL-17+CD8細(xì)胞明顯高于另外2組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 研究組中不同HBeAg/Ab表達(dá)組間γδT細(xì)胞和CD8細(xì)胞及其亞群的對(duì)比結(jié)果

注：與HBeAg+/Ab-組比較，aP<0.05；與HBeAg+/Ab+組比較，bP<0.05。

2.3慢性乙型肝炎患者HBeAg/Ab不同表達(dá)組血清內(nèi)HBV-DNA水平對(duì)比 單因素方差分析結(jié)果顯示，HBeAg/Ab不同表達(dá)組中，ALT正常者、ALT異常者2個(gè)亞組及匯總合計(jì)的HBV-DNA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，HBeAg+/Ab-組慢性乙型肝炎患者血清內(nèi)HBV-DNA水平要明顯高于HBeAg+/Ab+組和HBeAg-/Ab+組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 研究組中不同HBeAg/Ab表達(dá)組HBV-DNA水平對(duì)比(拷貝/毫升，

注：與HBeAg+/Ab-組比較，aP<0.05；與HBeAg+/Ab+組比較，bP<0.05。

3 討 論

根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》(2015版)[4]，以HBeAg+轉(zhuǎn)化為HBeAb+的血清學(xué)轉(zhuǎn)換作為臨床慢性乙型肝炎患者治療有效的滿意狀態(tài)，說(shuō)明乙型肝炎病毒的病變及免疫清除呈現(xiàn)靜止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)患者血清內(nèi)的HBV-DNA含量能夠反映乙型肝炎病毒復(fù)制的程度。慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明，一般認(rèn)為，HBV雖未直接殺傷肝細(xì)胞，但卻可以引發(fā)異常的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷和炎癥的發(fā)生。研究表明，淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能紊亂、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞及其相應(yīng)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生在這一病理?yè)p傷過(guò)程發(fā)揮重要的作用[5]。一方面，這種免疫應(yīng)答過(guò)程對(duì)疾病的恢復(fù)及病毒的清除有一定的促進(jìn)作用；另一方面，因?yàn)檎{(diào)節(jié)因子的不平衡又可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)HBV感染細(xì)胞的應(yīng)答而致使肝臟損傷[6]。固有免疫在HBV感染初期發(fā)揮作用，而特異性免疫應(yīng)答在感染持續(xù)過(guò)程中發(fā)揮主要作用。

γδT細(xì)胞是參與固有免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞群[7]，其可直接識(shí)別蛋白質(zhì)或抗原肽，具有迅速激活的動(dòng)力學(xué)特征，可快速、有效地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，γδT細(xì)胞可分為Vγ1、Vγ2和Vγ3這3個(gè)亞型。根據(jù)功能的差異，又可將γδT細(xì)胞劃分成IFN-γ的γδT細(xì)胞(IFN-γ+γδT)、產(chǎn)生IL-17的γδT細(xì)胞(IL-17+γδT)和調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞等亞群[8]。 IFN-γ+γδT細(xì)胞可以生成IFN-γ，介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)，在抗細(xì)胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用。IL-17+γδT細(xì)胞可以分泌IL-17，刺激細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，清除病原體并介導(dǎo)炎性反應(yīng)。CONROY等[9]的研究顯示，與對(duì)照組相比，無(wú)癥狀的慢性持續(xù)性乙型肝炎患者具有較高的Vγ1、Vγ2。另外，無(wú)癥狀患者組的Vγ2細(xì)胞表達(dá)更高水平的IFN-γ，提示IFN-γ+Vδ2細(xì)胞可能在慢性乙型肝炎病情控制中發(fā)揮重要作用。

本研究顯示，γδT細(xì)胞在慢性乙型肝炎患者PBMC中的比例顯著增高，提示γδT細(xì)胞的異常表達(dá)參與慢性乙型肝炎疾病的發(fā)生發(fā)展。另外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示，研究組IFN-γ+γδT明顯高于對(duì)照組，但I(xiàn)L-17+γδT在研究組和對(duì)照組差異不明顯。提示γδT細(xì)胞可能主要通過(guò)IFN-γ的細(xì)胞免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)作用參與慢性乙型肝炎的進(jìn)程，考慮可能的機(jī)制為IFN-γ+γδT細(xì)胞通過(guò)生成IFN-γ，誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞活化和增殖，對(duì)乙型肝炎病毒的清除具有種重要作用[10-11]。此外，在患者研究組內(nèi)可以觀察到γδT在HBeAg+/Ab+組與HBeAg-/Ab+組表達(dá)具有顯著差異，而在HBeAg+/Ab+和 HBeAg+/Ab-組間多無(wú)顯著性差異，提示γδT細(xì)胞在慢性乙型肝炎中HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換作用，且其效應(yīng)可能發(fā)生在血清轉(zhuǎn)換過(guò)程的后期。而IFN-γ+γδT在研究組之間并無(wú)差異，提示γδT細(xì)胞在HBeAg轉(zhuǎn)換的作用并非IFN-γ+γδT亞群引起的，可能有其他機(jī)制，考慮γδT細(xì)胞可能通過(guò)其分泌的其他細(xì)胞因子或參與的信號(hào)通路對(duì)HBeAg進(jìn)行血清學(xué)轉(zhuǎn)換，這需要進(jìn)一步的研究。

既往研究顯示，產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞在多種疾病的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著重要作用[12]。除了CD4細(xì)胞(Th17)外， CD8細(xì)胞也可以分泌IL-17，此類細(xì)胞被稱為“Tc17”細(xì)胞[13]。Tc17的主要功能是通過(guò)分泌IL-17、TNF和IL-22等細(xì)胞因子發(fā)揮促炎作用。與Th17細(xì)胞相似，Tc17也是一種可塑性極強(qiáng)的細(xì)胞，可轉(zhuǎn)化為分泌IFN-γ的類似Tc1細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞毒作用[14]。

王娟華等[15]的研究顯示，重度肝損傷患者組的Tc17明顯低于輕度和無(wú)肝損傷患者組。此外，在對(duì)丙型肝炎患者的研究中也發(fā)現(xiàn)，在低炎癥活動(dòng)的丙型肝炎患者的IL-17+CD8細(xì)胞明顯高于高活動(dòng)性的患者，提示IL-17+CD8細(xì)胞，即Tc17細(xì)胞可能對(duì)肝炎患者起著某種保護(hù)作用[16]。本研究進(jìn)一步對(duì)研究組不同分組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在處于轉(zhuǎn)歸中間態(tài)的HBeAg+/Ab+組中可以觀察到IL-17+CD8水平與轉(zhuǎn)化前后的HBeAg+/Ab-和 HBeAg-/Ab+組有顯著性差異，提示HBeAg/Ab的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化過(guò)程與Tc17這一具有細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)。IL-17+CD8細(xì)胞的升高，提示Tc17細(xì)胞可能通過(guò)分泌相關(guān)細(xì)胞因子，如IL-17等募集、激活效應(yīng)細(xì)胞至炎癥部位，促進(jìn)乙型肝炎保護(hù)性抗體的產(chǎn)生，清除病原體，對(duì)肝炎患者肝臟進(jìn)行保護(hù)。Tc17細(xì)胞的升高預(yù)示HBeAg/Ab的正向轉(zhuǎn)換的可能性增大，從而對(duì)乙型肝炎的病情具有一定的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)作用。

復(fù)制病毒與宿主之間免疫損傷的反應(yīng)為肝損傷，患者體內(nèi)的HBV-DNA含量能夠反映患者體內(nèi)病毒的復(fù)制情況，就本研究結(jié)果來(lái)看，HBeAg+/Ab-組慢性乙型肝炎患者血清內(nèi)HBV-DNA水平要明顯高于HBeAg+/Ab+組和HBeAg-/Ab+組，而HBeAg+/Ab+組的HBV-DNA也低于HBeAg-/Ab+組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示隨著HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的進(jìn)程，HBV的復(fù)制程度及傳染性強(qiáng)度隨之下降；γδT和Tc17的水平在一定程度上能夠預(yù)測(cè)患者體內(nèi)HBV的復(fù)制情況。

本研究仍然存在樣本數(shù)量較少，研究不夠透徹等缺點(diǎn)和其他待解決的問(wèn)題，γδT細(xì)胞對(duì)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的作用機(jī)制尚不明確，為此，筆者將會(huì)繼續(xù)進(jìn)行大樣本詳細(xì)分析，爭(zhēng)取進(jìn)一步深入研究乙型肝炎患者PBMC中IFN-γ+γδT細(xì)胞、 IL17+γδT細(xì)胞數(shù)量及γδT其他亞群與血清中HBeAg/Ab之間的相關(guān)性及其臨床意義。

4 結(jié) 論

綜上所述，血清中呈現(xiàn)HBeAg+/Ab+的慢性乙型肝炎患者外周血內(nèi)γδT和Tc17的水平較高，其理論在臨床上能夠幫助乙型肝炎患者進(jìn)行早期、及時(shí)的診斷，患者能受到更有效的治療。乙型肝炎患者體內(nèi)Tc17的頻率變化對(duì)抗病毒治療的應(yīng)答具有預(yù)測(cè)意義，對(duì)臨床上乙型肝炎的治療起到一定的促進(jìn)作用。