采用Allergy Lateral Flow Assay檢測(cè)過(guò)敏原特異性IgE抗體的性能評(píng)價(jià)1

陳輝雄，胡海圣，羅文婷，吳澤鴻，孫寶清△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州 510120；2.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518172；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科/呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510120)

由IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)尤為常見(jiàn)，如哮喘、過(guò)敏性鼻炎和食物過(guò)敏等[1-3]。目前，過(guò)敏的檢測(cè)主要有體內(nèi)皮膚試驗(yàn)和體外血清學(xué)檢測(cè)2種，1959年EBRUSTER首次報(bào)道使用皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)作為Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的一線檢測(cè)方法[4]，至今在許多國(guó)家仍被醫(yī)生首選為可靠的檢測(cè)方法。但皮膚點(diǎn)刺的使用較為受限，如易受操作者技術(shù)熟練程度的影響,結(jié)果判讀帶有主觀性而不能標(biāo)準(zhǔn)化及易使患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，包括皮疹、腫脹、惡心，甚至過(guò)敏性休克等[5-6]。而體外sIgE試驗(yàn)不受皮膚、藥物的影響，且安全性較好[7]，因此，體外檢測(cè)sIgE是尋找臨床相關(guān)過(guò)敏原的安全快捷手段，對(duì)于過(guò)敏性疾病的診斷、治療和預(yù)防有著重要作用。體外ImmunoCAP系統(tǒng)(Thermo Fisher,Uppsala,Sweden)，因其良好的可靠性、重復(fù)性及全自動(dòng)的技術(shù)，被視為體外sIgE檢測(cè)方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]，但該系統(tǒng)需要精密的儀器與熟練的操作技術(shù)，這不僅增加了患者的檢測(cè)費(fèi)用，還難以在醫(yī)療條件落后的地區(qū)開(kāi)展。因此，尋找簡(jiǎn)單、快速及性價(jià)比高的過(guò)敏原sIgE篩查技術(shù)，使基層易于建立并減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)有著重要的幫助。膠體金法已經(jīng)廣泛用于資源缺乏或非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的定性、半定量和定量監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)范圍包括生物醫(yī)學(xué)、植物檢疫、獸醫(yī)、飼料/食品、環(huán)境中的病原體、藥和代謝物等。作為過(guò)敏原檢測(cè)膠體金法新工藝的代表， Allergy Lateral Flow Assay (ALFA，Dr.Fooke Laboratorien GmbH,Neuss,Germany)具有小巧、價(jià)廉等特點(diǎn)，且能根據(jù)需求靈活地替換過(guò)敏原并包被在一個(gè)開(kāi)放式結(jié)構(gòu)的Basis Set側(cè)流裝置上[9]。由于該技術(shù)較新且國(guó)內(nèi)外這方面的研究較少，因此，本研究以ImmunoCAP系統(tǒng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，使用ALFA技術(shù)對(duì)中國(guó)南方地區(qū)過(guò)敏性疾病患者進(jìn)行過(guò)敏原檢測(cè)，探討ALFA的檢驗(yàn)效能及在中國(guó)南方的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2017年8-12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科/呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物資源庫(kù)100例過(guò)敏性疾病患者為研究對(duì)象，所有患者均簽署知情同意書(shū)，經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)為GYFYY-2016-73。患者納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)年齡1～75歲；(2)具有過(guò)敏相關(guān)病史或臨床癥狀，如喘息、呼吸困難，慢性的咳嗽，過(guò)敏性鼻炎如打噴嚏、流鼻涕、鼻塞或鼻癢，皮膚過(guò)敏如出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)、瘙癢或蕁麻疹；(3)經(jīng)ImmunoCAP檢測(cè)血清屋塵螨、粉塵螨、熱帶無(wú)爪螨、貓毛皮屑、狗毛皮屑、蟑螂和艾蒿sIgE至少1種為陽(yáng)性(≥0.35 kU/L)。排除標(biāo)準(zhǔn)：正在進(jìn)行特異性免疫治療，或合并有免疫缺陷、寄生蟲(chóng)感染、惡性腫瘤及免疫相關(guān)疾病的患者。

1.2方法 所有患者均使用含分離凝膠的真空采血管抽取靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上層血清標(biāo)本置于-80 ℃冰箱長(zhǎng)期存儲(chǔ)待測(cè)。分別同時(shí)使用ImmunoCAP 和ALFA技術(shù)對(duì)患者血清進(jìn)行屋塵螨、粉塵螨、熱帶無(wú)爪螨、貓毛皮屑、狗毛皮屑、蟑螂及艾蒿過(guò)敏原sIgE的檢測(cè)，均根據(jù)廠家的儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。2種檢測(cè)系統(tǒng)根據(jù)sIgE水平劃分等級(jí)區(qū)間：0級(jí)(≤0.34 kU/L)、1級(jí)(0.35～0.69 kU/L)、2級(jí)(0.70～3.49 kU/L)、3級(jí)(3.50～17.49 kU/L)、4級(jí)(17.50～49.99 kU/L)、5級(jí)(50.00～99.99 kU/L)和6級(jí)(≥100.0 kU/L)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS23.0 (IBM Corp.,Armonk,NY) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。ALFA診斷效能如特異度、靈敏度、陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值的計(jì)算是以ImmunoCAP為“金標(biāo)準(zhǔn)”?？傄恢滦?(兩者均陽(yáng)性數(shù)+兩者均陰性數(shù))×100/總測(cè)試數(shù)。由于檢測(cè)例數(shù)較少時(shí)，會(huì)影響總體一致性比率，因此，檢測(cè)的總體一致性結(jié)果通過(guò)Cohen′s Kappa Analysis檢測(cè)一致性，Kappa指數(shù)解讀如下:一致性很好(0.80～1.00)、一致性好(0.60～0.79)、中等(0.40～0.59)，一般(0.20～0.39)和差(<0.20)。Weighted Cohen′s Kappa分析用于sIgE等級(jí)之間的一致性檢測(cè)，一致性系數(shù)分別以“κ”和“κw”表示；Intra-class Correlation Analysis和Kendall′s Tau Analysis分別用于sIgE水平和sIgE等級(jí)之間關(guān)系的分析；相關(guān)系數(shù)分別以“rI”和“rK”表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1一般資料 研究入組了100例過(guò)敏性疾病患者，年齡8.3～41.0歲，平均年齡為24.5歲，女性占39%。其中27%為哮喘患者，30%為過(guò)敏性鼻炎患者，22%為同時(shí)合并鼻炎和哮喘患者，19%為食物過(guò)敏患者，2%為過(guò)敏性皮炎患者。

2.2ALFA與ImmunoCAP定性檢測(cè)結(jié)果一致性情況 以ImmunoCAP為“金標(biāo)準(zhǔn)”，粉塵螨(92.7%，κ=0.56)的總一致率最好，其次為貓毛皮屑(73.7%，κ=0.43)，最差的為蟑螂(50.0%，κ=0.07)。見(jiàn)表1。

表1 ALFA與ImmunoCAP定性檢測(cè)結(jié)果一致性情況

注：一致性分析，aP<0.05。

2.3ALFA檢測(cè)過(guò)敏原的診斷效能 0.35 kU/L做陽(yáng)性臨界值時(shí)，ALFA檢測(cè)粉塵螨的Youden指數(shù)最高，這時(shí)靈敏度為94.1%，特異度為75.0%，而熱帶無(wú)爪螨、貓毛皮屑和屋塵螨的Youden指數(shù)范圍在0.40～0.48。另外，ALFA檢測(cè)塵螨的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均在90%以上(96.2%～98.0%)，且在檢測(cè)貓毛皮屑時(shí)有較高的陰性預(yù)測(cè)值(85.3%)。繪制受試者工作特征曲線分析顯示，粉塵螨、屋塵螨的曲線下面積均大于0.90(P<0.05)；而熱帶無(wú)爪螨和貓毛皮屑的曲線下面積分別為0.86和0.79(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 ALFA檢測(cè)過(guò)敏原的診斷效能

注：aP<0.05。

注：A表示屋塵螨；B表示粉塵螨；C表示熱帶無(wú)爪螨；D表示貓毛；E表示狗毛；F表示蟑螂；G表示艾蒿。

圖1 ALFA與ImmunoCAP定量檢測(cè)sIgE水平散點(diǎn)圖

2.4ALFA與ImmunoCAP檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析 分析ALFA與ImmunoCAP檢測(cè)各過(guò)敏原的等級(jí)相關(guān)性顯示，兩方法學(xué)檢測(cè)粉塵螨、屋塵螨過(guò)敏原sIgE的相關(guān)性最強(qiáng)(rk>0.8,P<0.05),其次為熱帶無(wú)爪螨(rk=0.72，P<0.05)，而貓毛皮屑(rk=0.55)和狗皮屑(rk=0.43)相關(guān)性較弱(P<0.05)。同時(shí)，ALFA與ImmunoCAP檢測(cè)屋塵螨、粉塵螨和貓毛皮屑時(shí)sIgE水平相關(guān)性均較好(rI> 0.8)，而熱帶無(wú)爪螨(rI=0.69,P<0.05)相關(guān)性稍差,狗毛皮屑(rI=0.58,P<0.05)相關(guān)性最弱。見(jiàn)圖1、表3。

表3 ALFA與ImmunoCAP檢測(cè)結(jié)果相關(guān)系數(shù)

注：經(jīng)Kendall及Intra-class相關(guān)性分析，aP<0.05。

3 討 論

ALFA技術(shù)在檢測(cè)過(guò)敏原時(shí)僅使用少量的血清/血漿，且能在面板上靈活更換個(gè)性化的多種過(guò)敏原進(jìn)行快速檢測(cè)?；谝陨咸攸c(diǎn)，使用膠體金法的ALFA檢測(cè)系統(tǒng)已在歐洲地區(qū)廣泛使用，且歐洲地區(qū)已有研究對(duì)梯牧草、蜜蜂毒液和大黃蜂毒液過(guò)敏原sIgE的診斷效能評(píng)價(jià)，研究顯示，與ImmunoCAP法比較，ALFA系統(tǒng)診斷以上3種過(guò)敏原均有良好的靈敏度和特異度(98.2%/100.0%,100.0%/83.0%,82.0%/97.0%)[10-11]。sIgE致敏譜可由于地域、種族、文化、飲食和生活方式等出現(xiàn)差異[12]，因此，本研究評(píng)價(jià)ALFA系統(tǒng)對(duì)中國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的吸入性過(guò)敏原sIgE的診斷效能。

ALFA與ImmunoCAP在診斷粉塵螨和貓毛皮屑過(guò)敏原sIgE致敏的總一致率(92.7%、73.7%)、陽(yáng)性符合率(94.1%、72.2%)及陰性符合率(75.0%、74.4%)最好，而屋塵螨的總一致率也高達(dá)87.6%，但κ值僅為0.27，由于屋塵螨是亞洲地區(qū)的優(yōu)勢(shì)過(guò)敏原，多數(shù)患者均合并屋塵螨陽(yáng)性，導(dǎo)致該研究納入的屋塵螨陰性例數(shù)少，這可能導(dǎo)致κ值下降。

目前，國(guó)際習(xí)慣將sIgE的陽(yáng)性臨界值定義為0.35 kU/L[13]，以ImmunoCAP作為“金標(biāo)準(zhǔn)”對(duì)照，評(píng)價(jià)新型檢測(cè)系統(tǒng)在該臨界值的診斷效能有一定必要性，ALFA系統(tǒng)在該臨界值下診斷屋塵螨、粉塵螨、熱帶無(wú)爪螨和貓毛皮屑sIgE致敏的Youden指數(shù)均>0.40，其中以粉塵螨效果最佳(Youden指數(shù)=0.67)，且這4種過(guò)敏原曲線下面積均在0.80～0.95(P<0.05)，提示ALFA系統(tǒng)對(duì)以上過(guò)敏原具有較好的診斷價(jià)值。

相比ImmunoCAP系統(tǒng)，ALFA系統(tǒng)對(duì)狗皮屑、蟑螂和艾蒿的診斷效能較差。分析原因有2點(diǎn)：(1) 由于過(guò)敏原粗提物，都是來(lái)自于自然界中的動(dòng)物、植物或微生物，而地域及自然環(huán)境的差異都會(huì)導(dǎo)致來(lái)源于自然界的過(guò)敏原致敏蛋白成分含量和活性的不同，如本研究使用中的狗過(guò)敏原，ALFA系統(tǒng)中過(guò)敏原粗體物主要致敏蛋白為狗皮脂，而ImmunoCAP主要為狗毛，所以導(dǎo)致檢測(cè)出現(xiàn)差異。(2)過(guò)敏原提取物沒(méi)有國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)，各原料和診斷試劑生產(chǎn)商都靠建立自己的室內(nèi)參考品來(lái)進(jìn)行質(zhì)量控制，如蟑螂目前缺乏單一具有免疫顯性的過(guò)敏原，而且多種蟑螂過(guò)敏原的IgE應(yīng)答模式復(fù)雜，導(dǎo)致蟑螂提取物難以標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)[14-15]。因此，臨床醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行診斷時(shí)不能僅僅依賴(lài)過(guò)敏原檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)結(jié)合患者病史及體格檢查等進(jìn)行綜合性診斷，減少漏診及誤診情況的出現(xiàn)。

粉塵螨、屋塵螨和貓毛皮屑有較好的等級(jí)一致性(κ>0.60)，但當(dāng)以±1個(gè)級(jí)別視為是一致等級(jí)時(shí)，狗毛皮屑等級(jí)一致率達(dá)87.0%，而艾蒿和蟑螂也有62.8%和57.7%，提示ALFA定位是快速篩查型的檢測(cè)方法，應(yīng)用±1級(jí)別的解讀更有意義。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，解讀過(guò)敏原等級(jí)探討致敏嚴(yán)重程度時(shí)，應(yīng)根據(jù)臨床需求場(chǎng)景進(jìn)行具體解讀，如需要進(jìn)行特異性免疫治療的患者，結(jié)合具體的特定等級(jí)顯得十分必要，而對(duì)于僅是篩查過(guò)敏原的患者，等級(jí)的一致性重視程度可以弱化。要注意的是，對(duì)于解讀低陽(yáng)性等級(jí)時(shí)，則需考慮結(jié)果對(duì)患者臨床癥狀及病史進(jìn)行綜合性判定。

本研究首次應(yīng)用ALFA系統(tǒng)檢測(cè)中國(guó)南方地區(qū)患者致敏情況，并與ImmunoCAP系統(tǒng)進(jìn)行比較，對(duì)推動(dòng)我國(guó)過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展具有重要意義，但該研究也存在不足之處，由于某些過(guò)敏原標(biāo)本的高陽(yáng)性級(jí)別 (>5級(jí))在臨床上難以獲取，使得樣本以低陽(yáng)性為主。

4 結(jié) 論

綜上所述，ALFA作為一種快速方便的篩查型檢測(cè)方法，由于無(wú)須昂貴的檢測(cè)儀器,小巧便捷，易于建立，價(jià)廉可靠,非常適合在社區(qū)醫(yī)院、鄉(xiāng)村醫(yī)院等醫(yī)療條件不足的地區(qū)推廣，使過(guò)敏原診斷在落后區(qū)域得以應(yīng)用，讓這些地區(qū)的患者能及時(shí)了解自身過(guò)敏情況，做到早診斷早預(yù)防，避免發(fā)展為更嚴(yán)重的慢性疾病如哮喘等。