全自動(dòng)粒子化學(xué)發(fā)光法在梅毒抗體篩查中的應(yīng)用與分析1

邵淑麗，李秋靜，耿建利，劉 鵬，曲業(yè)敏，宋 宇，王曉偉，姚繼承，王明義△

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院：1.中心實(shí)驗(yàn)室；2.病理科；3.肝膽外科,山東威海 264200;4.威海威高生物科技有限公司,山東威海 264200)

梅毒是由梅毒螺旋體感染所致的慢性性傳播疾病，對(duì)人類的身體健康危害較大[1-2]。近年來(lái)，梅毒的發(fā)病率和流行范圍不斷增加[3-5]，因此，對(duì)梅毒的及時(shí)診斷就顯得至關(guān)重要。微粒子化學(xué)發(fā)光免疫法(CMIA)是近年來(lái)應(yīng)用于檢測(cè)梅毒特異性抗體的一項(xiàng)新技術(shù)，自動(dòng)化程度高，檢測(cè)簡(jiǎn)捷，應(yīng)用前景良好[6-7]。但CMIA作為梅毒特異性抗體的篩查試驗(yàn)，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性[7]。甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)主要用于梅毒非特異性抗體的檢測(cè)[8-9]，梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)是目前較為認(rèn)可的梅毒確證試驗(yàn)方法[10]。因此，本文主要對(duì)微粒子化學(xué)發(fā)光分析儀Autolumis 3000在梅毒抗體篩查中的應(yīng)用與分析進(jìn)行闡述，以CMIA進(jìn)行初篩，TPPA試驗(yàn)作為參比方法進(jìn)行復(fù)檢，并對(duì)二者檢測(cè)結(jié)果不相符的標(biāo)本采用免疫印跡法(Western blot)進(jìn)行確證，評(píng)價(jià)威高Autolumis 3000微粒子化學(xué)發(fā)光分析儀在檢測(cè)梅毒特異性抗體中的應(yīng)用與分析，以提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)梅毒檢出的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2018年3月10日至2019年3月10在大連醫(yī)科大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院體檢、門(mén)診及住院患者共36 854例的血清標(biāo)本。

1.2試劑與方法 所有患者的血清標(biāo)本均采用威高生物科技有限公司Autolumis 3000全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑進(jìn)行檢測(cè),在室內(nèi)質(zhì)控在控的情況下檢測(cè)，質(zhì)控品和定標(biāo)液均購(gòu)自威高生物科技有限公司，威高Autolumis 3000微粒子化學(xué)發(fā)光分析儀采用的是雙抗原夾心法來(lái)測(cè)定患者血清梅毒特異性抗體，即在磁微粒上共價(jià)包被梅毒螺旋體抗原，加入待測(cè)樣本和測(cè)梅毒螺旋體抗體示蹤結(jié)合物，形成包被抗原-抗體-異魯米諾標(biāo)記抗原復(fù)合物，充分反應(yīng)后洗滌，加入激發(fā)液，異魯米諾在激發(fā)液的作用下發(fā)光，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)與血清/血漿中梅毒抗體含量呈正相關(guān)，根據(jù)S/CO值對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。TRUST試劑購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司；TPPA試劑購(gòu)自日本富士株式會(huì)社；Western blot試劑購(gòu)自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國(guó))有限公司。CMIA結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：S/CO≥1判定為陽(yáng)性，<1判定為陰性。對(duì)初篩試驗(yàn)陽(yáng)性的判斷：需對(duì)CMIA陽(yáng)性標(biāo)本采用同種試劑進(jìn)行二次復(fù)檢,結(jié)果一致方可確定。對(duì)初篩陽(yáng)性標(biāo)本附加TRUST試驗(yàn)，采用TPPA試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢，并對(duì)TPPA結(jié)果陰性的標(biāo)本進(jìn)行Western blot確證。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)梅毒螺旋體Tp15、Tp17、Tp45和Tp47蛋白的IgM抗體，Western blot結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：至少出現(xiàn)2條條帶則判定為陽(yáng)性結(jié)果，若僅出現(xiàn)1條條帶為可疑結(jié)果，無(wú)條帶出現(xiàn)為陰性結(jié)果。上述所有試驗(yàn)均按照儀器及試劑盒操作使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Microsoft Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)，再使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究數(shù)據(jù)為計(jì)數(shù)資料，以率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，并采用特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值等分析各個(gè)方法的診斷效能，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CMIA初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的544份標(biāo)本的TRUST檢測(cè)結(jié)果 梅毒檢測(cè)標(biāo)本共36 854份；經(jīng)CMIA初篩實(shí)驗(yàn)檢出544份陽(yáng)性標(biāo)本，其中男性標(biāo)本287份，女性標(biāo)本257份。但TRUST共檢出314份陽(yáng)性標(biāo)本，其中男性標(biāo)本156份，男性檢出率是CMIA初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的54.36%(156/287)；女性標(biāo)本158份，女性檢出率是CMIA初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的61.48%(158/257)。見(jiàn)表1。

2.2CMIA初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的544份標(biāo)本的TPPA檢測(cè)結(jié)果 CMIA初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的544份標(biāo)本經(jīng)TPPA復(fù)查，檢出526份陽(yáng)性標(biāo)本，18份陰性標(biāo)本，其中男性標(biāo)本261例，女性標(biāo)本265例，CMIA初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的544份標(biāo)本的TRUST和TPPA檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出，特異度為99.95%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.69%。

表1 CMIA初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的544份標(biāo)本的TRUST和TPPA檢測(cè)結(jié)果比較(n)

2.3CMIA檢測(cè)結(jié)果S/CO分段值與TPPA、TRUST結(jié)果比較 544份CMIA初篩陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果S/CO值分段與TPPA、TRUST結(jié)果比較見(jiàn)表2，其中S/CO最小值為1.19，S/CO最大值為293.50。在TPPA陽(yáng)性結(jié)果中，當(dāng)S/CO≥10時(shí)99.58%為陽(yáng)性，S/CO<10只有75.00%為陽(yáng)性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在TPPA陰性結(jié)果中，CMIA的S/CO≤10共出現(xiàn)16份，占88.89%(16/18)。其中S/CO值在1～<3出現(xiàn)6份，占33.33%；3～<5出現(xiàn)4份，占22.22%；5～<7出現(xiàn)3份，占16.66%；7～<10出現(xiàn)3份，占16.66%。結(jié)果表明在S/CO<10的血清樣本中，隨著S/CO值的減小，TPPA陰性比例越來(lái)越高。在526份TPPA陽(yáng)性結(jié)果中，TRUST檢測(cè)出214份陰性，312份陽(yáng)性，隨著S/CO值的增加，滴度≥1∶2的份數(shù)也明顯增多；在18份TPPA陰性結(jié)果中，TRUST陰性標(biāo)本16份，陽(yáng)性標(biāo)本2份，均未出現(xiàn)滴度≥1∶2的結(jié)果。

2.4Western blot檢測(cè)結(jié)果 544份CMIA初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的標(biāo)本經(jīng)TPPA復(fù)查，檢測(cè)出526份標(biāo)本呈現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果，而18份標(biāo)本呈現(xiàn)出陰性結(jié)果。對(duì)CMIA和TPPA 2種檢測(cè)方法檢出結(jié)果不相符合的18份陰性標(biāo)本繼續(xù)采用Western blot法進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果顯示18份標(biāo)本中的2份呈現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果，5份標(biāo)本的結(jié)果為不確定，剩下的11份標(biāo)本為陰性結(jié)果。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果不確定的標(biāo)本不納入統(tǒng)計(jì)計(jì)算范圍，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CMIA法檢測(cè)梅毒抗體的特異度為99.97%。

表2 CMIA檢測(cè)結(jié)果S/CO值分段與TPPA、TRUST結(jié)果比較

3 討 論

近年來(lái)，梅毒的發(fā)病率逐年遞增[10]，因此，準(zhǔn)確、快速地診斷對(duì)疾病控制和患者管理具有重要意義。人類感染梅毒螺旋體后會(huì)產(chǎn)生2種抗體，一種是非特異性抗體，一種是特異性抗體。目前實(shí)驗(yàn)室多采用TRUST、TPPA及CMIA等方法對(duì)梅毒抗體進(jìn)行檢測(cè)[11]。在本研究中，通過(guò)CMIA初篩實(shí)驗(yàn)共檢出544份陽(yáng)性標(biāo)本，在544份CMIA初篩陽(yáng)性結(jié)果中，TRUST檢出314份陽(yáng)性標(biāo)本，230份陰性標(biāo)本，兩者的檢出率差異顯著。544份初篩陽(yáng)性標(biāo)本中經(jīng)TPPA復(fù)查檢出526份陽(yáng)性標(biāo)本，18份陰性標(biāo)本，兩者陽(yáng)性檢出率無(wú)顯著性差異，與賈敏利等[12]的報(bào)道相一致。

TRUST與CMIA檢出率差異明顯，這是由于TRUST是利用正常牛心肌的心類脂作為抗原來(lái)測(cè)定患者血清中的反應(yīng)素，即非特異性抗體-抗心磷脂抗體[13]。而本文Autolumis 3000微粒子化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)梅毒特異性抗體的原理是利用雙抗原夾心法來(lái)測(cè)定抗TP的特異性抗體。由于TRUST檢測(cè)的非特異性抗體的出現(xiàn)時(shí)間滯后于CMIA檢測(cè)的特異性抗體，且非特異性抗體在梅毒治療后或疾病晚期可能減少，故TRUST的靈敏度低于CMIA[10,13]。此外，除梅毒患者之外，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、麻風(fēng)、結(jié)核、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等非梅毒患者體內(nèi)也可以短暫地或長(zhǎng)期地存在抗心磷脂抗體，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[14]。因此，單獨(dú)的TRUST陽(yáng)性結(jié)果對(duì)臨床診斷的指導(dǎo)意義并不大，其檢測(cè)靈敏度、特異度均低于CMIA[15]。TPPA作為梅毒感染檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，和CMIA一樣檢測(cè)的是梅毒特異性抗體，其原理是采用超聲裂解后的梅毒螺旋體作為抗原，致敏紅色明膠顆粒與人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)紅色凝集反應(yīng)，即便行抗梅毒治療后TPPA結(jié)果也會(huì)終身陽(yáng)性[12,15]。雖然TPPA的靈敏度和特異度均較高，但其相較于CMIA而言，檢測(cè)費(fèi)用較為昂貴，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，加樣過(guò)程需手工稀釋，檢測(cè)結(jié)果也要肉眼判斷，人為干擾因素多，且待檢標(biāo)本量較大時(shí)并不適用，一般是作為篩選試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)本的確診試驗(yàn)[8,16]。因此，在梅毒特異性抗體的篩查過(guò)程中，CMIA相較于TRUST、TPPA而言，既兼顧了靈敏度高、特異度強(qiáng)、穩(wěn)定性好、檢測(cè)簡(jiǎn)捷的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)又規(guī)避了費(fèi)用昂貴、檢測(cè)人為干擾因素多、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，發(fā)展前景良好[17]。

對(duì)TPPA檢測(cè)出18份結(jié)果不相符(陰性)的標(biāo)本采用Western blot法進(jìn)行確證，本研究中Western blot僅檢出2份陽(yáng)性，5份不確定，11份陰性結(jié)果，說(shuō)明TPPA方法作為CMIA初篩的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，可有效降低Western blot驗(yàn)證的檢測(cè)成本。在去除不確定結(jié)果后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，Autolumis 3000檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體特異度較高(99.97%)。此外，S/CO越小，CMIA出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能性越大，尤其是S/CO≤10的標(biāo)本。

截至目前，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀在臨床篩檢過(guò)程中應(yīng)用廣泛，而其中Autolumis 3000檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體作為初篩實(shí)驗(yàn)的特異度及靈敏度良好，適合大批量樣本的篩查，尤其是血站、各級(jí)醫(yī)院及血液中心等機(jī)構(gòu)中應(yīng)用更為廣泛。但同時(shí)也有研究顯示，當(dāng)患者身患類風(fēng)濕疾病、糖尿病、惡性腫瘤等疾病時(shí)，CMIA的檢測(cè)結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性[7,14]。在利用Autolumis 3000檢測(cè)梅毒螺旋體的過(guò)程中，不僅需要檢驗(yàn)技術(shù)人員認(rèn)真分析檢測(cè)過(guò)程是否存在錯(cuò)誤外,更要全面了解患者此前是否有過(guò)感染性疾病、免疫功能紊亂等其他疾病史，在此基礎(chǔ)上才能作出正確的判斷,防止給患者帶來(lái)不必要的心理負(fù)擔(dān)。

4 結(jié) 論

以Autolumis 3000 CMIA為例檢測(cè)梅毒特異性抗體的特異度高，可以滿足臨床對(duì)梅毒抗體檢測(cè)快速、準(zhǔn)確的要求。對(duì)于CMIA初篩陽(yáng)性標(biāo)本可選用TPPA試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢；特別是S/CO≤10的標(biāo)本，要注意假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，采用2種以上的方法進(jìn)行復(fù)查。綜上所述，CMIA檢測(cè)梅毒特異性抗體的特異度高，靈敏度好，相較于TRUST、TPPA更適用于臨床大量樣本的篩查，適合在臨床進(jìn)行推廣。