膽石病患者膽汁酸代謝輪廓分析1

段銀環(huán)，畢小云△，邵 勇，李 歡

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院：1.檢驗科；2.產(chǎn)科，重慶 400046)

膽石病是臨床最常見的消化系統(tǒng)疾病之一，其成石機制目前仍不十分清楚。研究表明,膽石病發(fā)病的根源是膽汁酸代謝紊亂及膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞[1]。膽汁酸代謝輪廓是反映生物體內(nèi)膽汁酸種類、水平、變化的指標。當肝臟發(fā)生病變或患膽管疾病時會引起膽汁酸代謝障礙，總膽汁酸早期不會發(fā)生明顯改變，而血清中各種亞型膽汁酸水平將產(chǎn)生相應(yīng)的變化，使血清中膽汁酸成分與水平顯著改變[2]。監(jiān)測人體內(nèi)膽汁酸代謝輪廓的特征有望用于肝膽疾病的早期診斷及鑒別診斷。因此，需要對膽石病患者血清中膽汁酸進行全面分析，以充分掌握與成石有關(guān)的膽汁酸的毒性作用及發(fā)現(xiàn)具有早期診斷作用的標志膽汁酸。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法同時檢測膽石病患者和健康志愿者(對照)血清中15種膽汁酸的水平，結(jié)合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)建立診斷區(qū)分模型，并初步探討血清膽汁酸代謝輪廓分析對膽石病的初步診斷價值及可能的成石機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 共收集2018年1月至2019年1月到重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院就診的膽石病患者及健康志愿者共84例為研究對象，其中對照組51例，膽石病組33例。清晨采集研究對象的空腹靜脈血3 mL，待標本凝固后離心，提取上層血清保存于-80 ℃冰箱直至上機分析。對照組納入標準：赴重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院體檢健康者；平均每天攝入乙醇量<20 g；在同期的醫(yī)學檢查中，肝腎功及血脂處于正常參考區(qū)間內(nèi)；無人患有糖尿病和血脂異常等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；無被診斷為膽結(jié)石或有任何肝腎功能障礙疾病或其他血液系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)疾病。膽石病組納入標準：經(jīng)影像學B超和(或)CT、MRI及逆行胰膽管造影(ERCP)檢查確診的膽石病患者，除外各種類型肝炎及其他原因引起的肝臟損傷，不合并糖尿病、代謝綜合征及其他慢性疾病。

1.2儀器與試劑 Waters Xevo TQD IVD 串聯(lián)質(zhì)譜；Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀；Masslynx 4.1工作站(美國Waters公司)；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50.0 mm×2.1 mm,1.7 μm)；Cobas c701全自動生化分析儀；甘氨石膽酸(GLCA)標準品購自Toronto Research Chemicals公司；膽酸(CA)、石膽酸(LCA)、脫氧膽酸(DCA)、熊脫氧膽酸(UDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、?；悄懰?TCA)、甘氨膽酸(GCA)、?；鞘懰?TLCA)、?；敲撗跄懰?TDCA)、?；切苊撗跄懰?TUDCA)、?；蛆Z脫氧膽酸(TCDCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)標準品及同位素標記的內(nèi)標氘代膽酸(d4-CA)、氘代脫氧膽酸(d4-DCA)、氘代熊甘氨膽酸(d5-GCA)、氘代熊脫氧膽酸(d4-UDCA)、氘代石膽酸(d4-LCA)均購自Sigma Aldrich公司。

1.3方法

1.3.1血清標本前處理 在0.25 mL血清標本中,加入1 mg/mL 內(nèi)標(3，12-二醇-7-一醇-5β-膽酸)甲醇液10 μL,加入甲醇4 mL，超聲震動20 min，4 000 g離心20 min，上清液在60 ℃用氮氣吹干。先依次各用2 mL的氯仿-甲醇(2∶1 V/V)、甲醇和水活化C18小柱。吹干的血清溶于1 mL水中,上樣。依次用2 mL水、2 mL正己烷沖洗,最后用5 mL甲醇洗脫。在60 ℃用氮氣吹干，殘余物溶于1 mL乙腈-水(1∶1)中。

1.3.2色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50.0 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液(體積比)，B相為0.1%甲酸-乙腈：甲醇(3∶1,v∶v)溶液； 流速：0.4 mL/min；柱溫：45 ℃；梯度洗脫程序：0～2.0 min,>35%～43%,B;>2.0～3.5 min,>43%～46%,B;>3.5～5.0 min,>46%～<59%,B;>5.0～7.0 min,59%,B;>7.0～8.7 min,>59%～66%,B;>8.7～10.7 min,>66%～98%,B;>10.7～11.3 min,35%,B。離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流速:800 L/h；錐孔氣流速:50 L/h。用時間分段來提高待測物響應(yīng)值，15種膽汁酸質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.3.3方法學評價及質(zhì)控 15種膽汁酸在1.0～6 000.0 nmol/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性決定系數(shù)(R2)均>0.993；目標物的定量限為1.0～10.0 nmol/L；低、中、高水平的萃取回收率在95.5%～114.1%，日內(nèi)、日間精密度(RSD)均<11.4%，15種膽汁酸的高低質(zhì)控變異系數(shù)<15%。

表1 15種膽汁酸質(zhì)譜參數(shù)

1.3.4特征標志膽汁酸的篩選 將數(shù)據(jù)導入SIMCA 13.0 (Umetrics 瑞典)軟件，結(jié)合PCA和OPLS-DA對血清膽汁酸譜進行分析，建立模式識別模型。再根據(jù)所得的投影重要性值(VIP)及其置信區(qū)間對標志物進行初步篩選，獲得對分組有貢獻的膽汁酸變量。篩選標準為：VIP>1且置信區(qū)間不包括0的膽汁酸。對初篩的標志物進行不同組間的非參數(shù)檢驗以尋找有差異的特征標志膽汁酸。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料 對照組與膽石病組相比，性別構(gòu)成(χ2=1.706,P=0.191)、直接膽紅素(DBil)(t=-2.020，P=0.052)差異無統(tǒng)計學意義，可排除性別對膽汁酸譜的影響。2組年齡、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBil)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組與膽石病組一般資料比較

注：與對照組比較，aP<0.05。

2.2構(gòu)建區(qū)分模型 將得到的膽汁酸數(shù)據(jù)導入SIMCA13.0軟件先進行無監(jiān)督的PCA分析，根據(jù)DModX及Loading plot對異常離群點(outlier)反復(fù)剔除后建立PCA模型，模型解釋力(R2X=83.9%)，預(yù)測力(Q2=43.9%)，見圖1。依據(jù)篩除后的數(shù)據(jù)構(gòu)建有監(jiān)督的OPLS-DA模型，見圖2。交叉驗證顯示預(yù)測能力Q2=20.8%，50.9%的變量[R2(X)]可用于解釋26.3%的組間差異[R2(X)]。從3D得分圖中可以看出對照組分布在右側(cè)，膽石病患者分布在左側(cè)，該模型篩選到的標志膽汁酸有GCDCA、CDCA、GUDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA。

注：N代表對照組，S代表膽石病組。A代表二維得分圖，B代表3D得分圖。

圖1基于對照與膽石病組的PCA模型

注：N代表對照組，S代表膽石病組。A代表二維得分圖，B代表3D得分圖。

圖2基于對照與膽石病組的OPLS-DA模型

表3 健康對照與膽石病膽汁酸代謝輪廓[nmol/L,M(P25,P75)]

注：與對照組相比，aP<0.05,bP<0.01。

2.3特征膽汁酸臨床價值評估 為探索這些標志膽汁酸對膽石病的診斷效能，將膽石病與對照組進行非參數(shù)檢驗，尋找有差異的標志膽汁酸。見表3。與對照組相比，膽石病組的GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TCDCA、TCA差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。對差異膽汁酸進行ROC曲線分析并計算他們的AUC，膽石病組TLCA的AUC為0.615(P<0.05)，認為有較好的區(qū)分效能,表4、見圖3。

表4 膽石病差異膽汁酸的AUC及P值

圖3 膽石病差異膽汁酸的ROC曲線及AUC

3 討 論

PCA是將多個指標的數(shù)據(jù)進行降維化為少數(shù)幾個指標的一種方法,它在盡可能保留原有信息的基礎(chǔ)上將樣本指標數(shù)壓縮,使數(shù)據(jù)矩陣簡化,降低維數(shù),PCA是通過分析可觀測的指標,提取幾個較少的綜合指標以揭示原來變量絕大多數(shù)信息的一種多元統(tǒng)計方法[3-5]。OPLS-DA是將正交信號校正方法(OSC)與偏最小二乘法(PLS)相互結(jié)合同時對偏最小二乘法進行改進。OPLS-DA可以更好地區(qū)分組間差異,提高模型的有效性和解析能力。目前，OPLS-DA在代謝組學研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其應(yīng)用價值也不斷被認可[6-7]。

膽石病是多因素作用的結(jié)果，研究表明膽石病發(fā)病的根源是膽汁酸代謝紊亂及膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法同時檢測膽石病患者和健康志愿者血清中15種膽汁酸的水平并分析膽汁酸亞組份的差異，建立區(qū)分模型，探討可能的成石機制。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，膽石病組的GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可以作為膽石病的標志膽汁酸，其中TLCA有一定的區(qū)分效能。

既往有研究表明，游離型膽汁酸的差異主要影響膽石病的形成[8]，這與本研究結(jié)果不符，本研究中，有差異的除CDCA是游離型膽汁酸外，GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA均為結(jié)合型膽汁酸，膽汁酸的毒性通常與其兩親性有關(guān)，大量毒性膽汁酸的堆積可誘導肝細胞的氧化應(yīng)激及凋亡，最終導致肝臟實質(zhì)損傷。有研究表明，DCA、LCA是毒性最大的疏水膽汁酸[9-11]，在本研究中未見明顯升高。事實上，?；墙Y(jié)合膽汁酸和甘氨結(jié)合型膽汁酸都是疏水性膽汁酸，具有相似的細胞毒性作用[10,12-14]。本研究中膽石病組GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA，與對照相比，差異均有統(tǒng)計學意義，可能是成石的主要因素，同時也可以解釋膽石病患者的肝功能損害。

LCA是CDCA在腸道細菌的作用下脫羥基形成的一種次級膽汁酸，既往有研究表明，LCA在無癥狀的膽石病患者血清中可測出，而在健康人血清中檢測不出，認為LCA可以用來鑒別膽石病的有無[15]，但也有學者在健康人血清標本中檢測出LCA[16]。在本研究中，LCA與對照比較，差異無統(tǒng)計學意義，而CDCA及TLCA水平差異有統(tǒng)計學意義，結(jié)合本研究結(jié)果，認為可以將血清TLCA作為區(qū)分膽石病與非膽石病的指標。

既往研究表明，血清DCA水平增多是結(jié)石形成的誘發(fā)因素之一[17]，本實驗中膽石病組血清樣本中DCA水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義。綜上所述，DCA在膽固醇結(jié)石形成中的作用存在爭議，仍需進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究中結(jié)合膽汁酸GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA的差異主要影響膽石的形成；TLCA可能是鑒別膽石病與非膽石病的指標，膽汁酸代謝輪廓對臨床診斷膽石病有較大的應(yīng)用價值，有望用于膽石病的早期診斷及鑒別診斷。