南、北山楂提取液分別對人體內(nèi)源淀粉酶作用研究

祁 靜， 楊 娟， 汪啟珍， 蔡炳民， 于 迪， 孫一銘

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 廣西 南寧 530200)

山楂的果實(shí)營養(yǎng)全面且豐富，市場上使用的山楂包括北山楂(Crataeguspinnatifida)、南山楂(野山楂，Crataeguscuneata)、廣山楂、云山楂等多個品種，其中以北山楂、南山楂(野山楂)應(yīng)用最多，分布最廣。在功效上，南山楂以行氣散瘀，收斂止瀉為主；北山楂以消食化積為主[1-2]。山楂中的主要功能性成分包括黃酮類化合物、有機(jī)酸、黃烷及其聚合物、微量元素及氨基酸等[3-6]，其中有機(jī)酸主要為檸檬酸、山楂酸、熊果酸、棕櫚酸、硬脂酸等[7]。

山楂的助消化機(jī)理研究，國內(nèi)外均有一些報(bào)道，近年的研究結(jié)果顯示，山楂水提物不僅能夠促進(jìn)胃腸平滑肌收縮，而且口服山楂液能增加胃中消化酶的分泌，增強(qiáng)酶的活性，促進(jìn)腸胃的消化功能[8]。山楂助消化的機(jī)理主要包括3點(diǎn)。1)山楂中的維生素C具有增加食欲的作用，有機(jī)酸等成分可以促進(jìn)胃液及胰液的分泌，從而起到助消化的作用[9-11]；2)山楂中的有機(jī)酸和黃酮類，可提高淀粉酶活性，起到助消化作用[12-13]；3)山楂可以加快胃腸排空速度[14-16]。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)所采用的材料均為食品級，試劑均為化學(xué)純，詳情見表1；本實(shí)驗(yàn)所采用的儀器設(shè)備詳情見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

表2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程為：糊化的淀粉加酶和山楂在振蕩器中反應(yīng)30 min→煮沸10 min滅酶活→過濾取樣→據(jù)葡萄糖試劑盒測定葡萄糖含量→紫外分光光度計(jì)測吸光度并計(jì)算。

1.2.2山楂水提液的制備

準(zhǔn)確稱取山楂50 g置于三角瓶中，按料液比1∶5加入250 mL蒸餾水，然后將三角瓶置于水浴鍋中，溫度分別保持在30、60、80 ℃，用玻璃棒攪拌，浸提30 min，浸提液經(jīng)過2次脫脂棉過濾和2次定性濾紙過濾后，定容到250 mL容量瓶中，待用。

1.2.3緩沖溶液的配制

1) 準(zhǔn)確稱取31.2 g NaH2PO4·2H2O置于1 000 mL燒杯中，再加入900 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙?，最終定容在1 000 mL的容量瓶中，得到0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液。

2) 準(zhǔn)確稱取61.632 g Na2HPO4·12H2O置于1 000 mL燒杯中，再加入900 mL蒸餾水，加熱溶解，冷卻后定容在1 000 mL的容量瓶中，得到0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液。

3) 在25 ℃下，準(zhǔn)確量取0.2 mol/L NaH2PO4溶液68.5 mL和0.2 mol/L Na2HPO4溶液31.5 mL，混合后再加400 mL蒸餾水，最終得到pH值為6.5，0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，密封待用。

1.2.4淀粉溶液的制備

準(zhǔn)確稱取4 g淀粉置于燒杯中，再加入pH值為6.5、濃度為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液90 mL，然后放入70 ℃水浴鍋中攪拌糊化30 min，最后加入緩沖液至100 mL，攪拌均勻，最終得到質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的淀粉溶液。

1.2.5淀粉酶溶液的配制

取出適量淀粉酶制劑于研缽中研磨，然后準(zhǔn)確稱取0.5 g置于燒杯中，并用適量緩沖溶液溶解，然后在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液。得到的上清液再經(jīng)定量濾紙過濾，最后定容于25 mL容量瓶中，即為0.02 g/mL淀粉酶溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.6淀粉消化率的測定方法

1.2.6.1 淀粉酶水解淀粉反應(yīng)

量取10 mL淀粉溶液于50 mL小燒杯中，加入1 mL淀粉酶溶液和1 mL山楂水提液混勻，分別設(shè)置不同的溫度，在恒溫培養(yǎng)振蕩器中反應(yīng)30 min，然后放入沸水浴中滅酶10 min，終止反應(yīng)后用定性濾紙過濾，得到澄清的濾液。最后采用葡萄糖試劑盒測定生成的葡萄糖量。

1.2.6.2 葡萄糖測定方法

按照葡萄糖試劑盒的說明進(jìn)行操作。

1)試劑工作液配制：將葡萄糖試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)工作液500 μL R1和500 μL R2混合均勻。

2)實(shí)驗(yàn)條件如表3。

3)樣品測定具體操作步驟及樣品校準(zhǔn)見表4。將工作液充分混勻后，在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，顯色后(顏色至少可穩(wěn)定2 h)在波長505 nm處，以空白管調(diào)零，讀取校準(zhǔn)管和樣本管的吸光度值(A)。

表3 葡萄糖測定條件

表4 樣品中葡萄糖含量測定

4)葡萄糖含量按照試劑盒提供的式(1)計(jì)算。

(1)

式(1)中，x為葡萄糖濃度，mmol/L;A1為樣品管吸光度；A2為校準(zhǔn)管吸光度；5.55為校準(zhǔn)管葡萄糖濃度，mmol/L。

5)溫度和pH值單因素實(shí)驗(yàn)的樣品中葡萄糖含量計(jì)算如式(2)。

Y1=X×12×10-3，

(2)

式(2)中，Y1為樣品中葡萄糖含量，mmol；X為反應(yīng)后溶液中的葡萄糖濃度，mmol/L；12×10-3為樣品的總體積，L。

6)離子因素實(shí)驗(yàn)樣品中葡萄糖含量計(jì)算如式(3)。

Y2=X×13×10-3，

(3)

式(3)中，Y2為樣品中葡萄糖含量，mmol；X為反應(yīng)后溶液中的葡萄糖濃度，mmol/L；13×10-3為樣品的總體積，L。

1.2.7實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

每個樣品作2個平行，每個平行取樣2個。實(shí)驗(yàn)中為減少葡萄糖濃度因液體體積不同而引起的變化，用緩沖溶液補(bǔ)足體積，使測試樣品溶液體積相同。各測定管的反應(yīng)體系如下：

對照組：10 mL淀粉+1 mL淀粉酶+1 mL緩沖液。

空白組：1 mL山楂液+11 mL緩沖液。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度對山楂與淀粉酶相互作用的影響

不同反應(yīng)溫度對淀粉酶與南山楂、北山楂相互作用的影響結(jié)果分別見表5和表6。

表5顯示，在反應(yīng)溫度依次遞增(分別為25、37、45 ℃)的條件下，淀粉酶與南山楂的30 ℃水提液相互作用后，水解淀粉生成的葡萄糖量依次遞減；而60 ℃提取的南山楂水溶液使淀粉酶水解淀粉生成的葡萄糖量呈現(xiàn)遞增趨勢。其中，在37 ℃的反應(yīng)條件下，淀粉酶與南山楂的80 ℃提取水溶液相互作用后，水解淀粉生成的葡萄糖量最少。

由表6可見，在37 ℃反應(yīng)條件下，淀粉酶與北山楂的60 ℃提取水溶液作用生成的葡萄糖量較其他2組多，且隨著反應(yīng)溫度的升高生成的葡萄糖量依次遞增。根據(jù)劉霞等[17]的研究，60 ℃提取得到的北山楂溶液中有機(jī)酸總含量最多。由此推測山楂提取液中的大量有機(jī)酸改變了環(huán)境的pH值，從而使淀粉酶的活性中心更活躍，從而提升了消化酶的活性。

表5 反應(yīng)溫度對淀粉酶與南山楂相互作用的影響

1)樣品組反應(yīng)體系為淀粉+淀粉酶+山楂；對照組為淀粉+酶。2)“+”和“-”表示溫度對淀粉酶與南山楂反應(yīng)的影響呈促進(jìn)或抑制作用。3)表中數(shù)據(jù)為南山楂提取液+淀粉+淀粉酶的葡萄糖生成量(mmol)。

表6 反應(yīng)溫度對淀粉酶與北山楂相互作用的影響

1)樣品組反應(yīng)體系為淀粉+淀粉酶+山楂；對照組為淀粉+酶。2)“+”和“-”分別表示溫度對淀粉酶與北山楂反應(yīng)的影響呈現(xiàn)促進(jìn)或抑制作用。3)*表示與同列對照組相比，樣品組數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)。4)表中數(shù)據(jù)為北山楂提取液+淀粉+淀粉酶的葡萄糖生成量(mmol)。

由表5和表6總結(jié)得出，只有60 ℃提取的北山楂能顯著提高淀粉的水解率，另外兩個溫度提取的北山楂溶液與對照組相比無顯著差異，且與南山楂對淀粉酶的作用相比亦無顯著性差異。

2.2 pH值對淀粉酶與山楂反應(yīng)的影響

在pH值分別為6.5和6.8的條件下，淀粉酶加淀粉體系分別與南山楂、北山楂反應(yīng)后生成的葡萄糖量見表7和表8。由表7和表8可知，在反應(yīng)溫度為37 ℃條件下，淀粉酶與各山楂提取液在pH值為6.5的反應(yīng)條件下水解淀粉生成的葡萄糖量較pH值為6.8的條件下生成的葡萄糖量高，而且當(dāng)pH值為6.5時，各山楂提取液對淀粉酶的活性均呈現(xiàn)出顯著的提升作用。

結(jié)果側(cè)面說明了山楂有機(jī)酸使腸道中的pH值降低后，有助于食物的消化。

綜上所述，在37 ℃，pH值為6.5的反應(yīng)條件下，南、北山楂的所有水提液均表現(xiàn)為酶活促進(jìn)作用，且強(qiáng)于pH值為6.8條件下的酶促作用，其中60 ℃的提取液酶促作用最強(qiáng)。由此可知，pH值對淀粉酶的活性影響很大。據(jù)報(bào)道，強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性環(huán)境都會降低淀粉酶的活性[18]，中性偏酸時淀粉酶活力較高[19]。人口腔中淀粉酶的最適pH值為6.8，而本實(shí)驗(yàn)中NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系的pH值為6.5，與小腸液的pH值條件最為相近，所以可推測山楂在小腸中可有效提高淀粉酶的活性。

另外，經(jīng)過比較表7和表8的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，南山楂的60 ℃提取液對淀粉酶的活性促進(jìn)作用最強(qiáng)，原因可能是60 ℃時得到的南山楂液中含有的黃酮類物質(zhì)最多，可以有效作用于淀粉酶的活性中心[20]。

表7 pH值對淀粉酶與南山楂反應(yīng)的影響

1)樣品組反應(yīng)體系為淀粉+淀粉酶+山楂；對照組為淀粉+酶。2)“+”和“-”表示pH值對淀粉酶與南山楂的反應(yīng)分別呈現(xiàn)促進(jìn)或抑制作用。3)*表示與同列對照組相比，樣品組數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)。4)表中數(shù)據(jù)為南山楂提取液+淀粉+淀粉酶的葡萄糖生成量(mmol)。

表8 pH值對淀粉酶與北山楂反應(yīng)的影響

1)樣品組反應(yīng)體系為淀粉+淀粉酶+山楂；對照組為淀粉+酶。2)“+”和“-”表示pH值對淀粉酶與北山楂的反應(yīng)分別呈現(xiàn)促進(jìn)或抑制作用。3)*表示與同列對照組相比，樣品組數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)。4)表中數(shù)據(jù)為北山楂提取液+淀粉+淀粉酶的葡萄糖生成量(mmol)。

2.3 陰陽離子環(huán)境對人體內(nèi)源淀粉酶與山楂反應(yīng)的影響

表對人體內(nèi)源淀粉酶與南山楂反應(yīng)的影響

2.3.2Zn2+對人體內(nèi)源淀粉酶與山楂反應(yīng)的影響

在淀粉酶與山楂反應(yīng)體系中，加入20 mmol/L 的Zn2+后，淀粉水解產(chǎn)生的葡萄糖量下降，見表11和表12，表明淀粉酶的活性有所下降。此結(jié)果與聶國興等[21]及張雨潔等[22]的研究結(jié)果相同，即Zn2+在一定濃度下對淀粉酶活性有抑制作用。因此，如果想獲得良好的山楂消食化積的作用，飲食中應(yīng)盡量避免山楂與富含Zn2+的食物同時食用。

表對人體內(nèi)源淀粉酶與北山楂反應(yīng)的影響

表11 Zn2+對人體內(nèi)源淀粉酶與南山楂反應(yīng)的影響

1)“+”和“-”表示Zn2+對淀粉酶與南山楂的反應(yīng)分別呈現(xiàn)促進(jìn)和抑制作用。2)表中數(shù)據(jù)為南山楂提取液+淀粉+淀粉酶的葡萄糖生成量(mmol)。

表12 Zn2+對人體內(nèi)源淀粉酶與北山楂反應(yīng)的影響

1)“+”和“-”表示加入Zn2+淀粉酶與北山楂的反應(yīng)分別呈現(xiàn)促進(jìn)和抑制作用；2)*表示與同列對照組相比，樣品組數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)。3)表中數(shù)據(jù)為北山楂提取液+淀粉+淀粉酶的葡萄糖生成量(mmol)。

3 結(jié) 論

南山楂與北山楂所含成分差異較大，其中最大的區(qū)別在于南山楂中總黃酮類含量較高，而北山楂中有機(jī)酸含量較高。在37 ℃，pH值為6.5的條件下，南、北山楂提取液均可在一定程度上提高淀粉酶的活性，起到助消化作用。20 mmol/L的 Zn2+對淀粉酶與山楂的反應(yīng)呈現(xiàn)出顯著的抑制作用。綜上所述，北山楂提取液在一定條件下能提高淀粉酶的活性，達(dá)到健胃消食，起到助消化作用，但飲食中要避免富含Zn2+的食物與山楂同食，以免引起消化不良。