黑米花青素延緩果蠅衰老作用研究

李 祥， 張曉寒， 韓 英， 王 浩， 張澤生,*

(1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院， 天津 300457；2.鹽城師范學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院， 江蘇 鹽城 224051)

花青素屬于黃酮類多酚物質(zhì)，在我們?nèi)粘ｏ嬍持泻艹Ｒ姡绕湓诩t色、藍(lán)色、黑色和紫色谷類、水果和蔬菜中[1]?；ㄇ嗨鼐哂休^強(qiáng)的清除氧自由基和抗氧化能力。近年來，花青素因其對人類的健康作用引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注[2]。據(jù)報道，從黑米[3]、藍(lán)莓[4]、紫玉米[5]、黑豆[1]、紫甘薯[6]等食物中提取的花青素在降脂、抗氧化等方面有一定的功效。黑米中的花青素以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷為主要成分[3]。有研究表明花青素的抗氧化能力比維生素C、維生素E和水溶性維生素E (trolox)強(qiáng)3～5倍[7]。Dias等報道黑米花青素的飲食可以降低某些癌癥、心臟病、糖尿病、阿爾茲海默癥和帕金森等疾病的風(fēng)險[8]。果蠅被認(rèn)為是理想的抗衰老研究生物模型，它生命周期短，容易飼養(yǎng)和易繁殖，并且和人類有許多共同的抗氧化系統(tǒng)和代謝途徑。因此，本研究選用果蠅作為模型生物，通過用黑米花青素(black rice anthocyanin, BRA)飼喂果蠅，研究黑米花青素對其壽命的影響，并進(jìn)一步探究延緩衰老的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米花青素由天津尖峰天然產(chǎn)物研究院提供，花青素成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:cyanidin-3,5-diglucoside (3.12%), cyanidin-3-O-glucoside (83.89%)，petunidin-3-O-glucoside (5.45%)；野生型黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)由筆者實(shí)驗(yàn)室提供；“藍(lán)精靈”(smurf)藍(lán)色染料，美國Sigma公司；cDNA合成試劑盒、Trizol試劑、SYBRgreen，寶生物工程(大連)有限公司；羅丹明B磺酸鈉鹽(sulforhodamine B sodium salt，SRB)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基的制作方法參考文獻(xiàn)[9]，即1 000 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含葡萄糖105 g、玉米粉105 g、酵母21 g、瓊脂13 g。培養(yǎng)基中添加w(4-羥基苯甲酸乙酯)=0.4%，以防止霉菌生長。對照組培養(yǎng)基參照基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基分別添加1 mg/mL或5 mg/mL的黑米花青素(分別記為BRA1和BRA5)。

1.2.2果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

選用2 d齡羽化未交配果蠅600只，隨機(jī)分為3組，每組200只。其中對照組以基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組BRA1和BRA5分別用添加1、5 mg/mL黑米花青素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)，于溫度為(25±1)℃，濕度為65%，交替12 h的光、暗恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d更換新鮮培養(yǎng)基并記錄果蠅死亡狀況，直至全部死亡。

1.2.3果蠅體重的測定

體重變化被用作測定食物攝入量的指標(biāo)。在飼養(yǎng)第20天和第50天，用CO2麻醉果蠅，然后稱量并計算果蠅平均體重。

1.2.4果蠅味覺的測定

圖1 果蠅的壽命曲線Fig.1 Lifespan curve of Drosophila melanogaster

通過進(jìn)行味覺測定測量果蠅的攝入量，方法參照文獻(xiàn)[9]。即在飲食中添加可見染料羅丹明B磺酸鈉鹽，以測量胃發(fā)紅，以評估食物攝入量。具體如下，在用蒸餾水浸泡的濾紙上飼養(yǎng)60只果蠅，共3管，禁食24 h。隨后，將果蠅放在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%羅丹明B磺酸鈉鹽的培養(yǎng)基中2 h。最后，采用從0級(無色腹部)到5級(完全紅色腹部)的分級量表，通過雙盲法評分法評估食物攝入量。

1.2.5果蠅爬行能力測定

在果蠅飼養(yǎng)第20天和第50天時，對其運(yùn)動能力進(jìn)行分析，方法參照文獻(xiàn)[10]。即在室溫下，選取每組100只果蠅，將果蠅轉(zhuǎn)移至干凈培養(yǎng)管，輕輕將果蠅抖落至瓶底，記錄30 s內(nèi)果蠅垂直向上爬行距離(測量分為3組，分別為小于2 cm、2～4 cm、大于4 cm)，測試3次。

1.2.6果蠅藍(lán)精靈測定

收集同一時期果蠅100只，分別培養(yǎng)20 d和50 d后，按照100 mL培養(yǎng)基中添加2 500 mg的藍(lán)色染料1號，在果蠅飼喂9 h后觀察其腹部顏色。全腹部出現(xiàn)藍(lán)色的果蠅為“藍(lán)精靈”果蠅，記錄各組藍(lán)精靈果蠅的數(shù)量。

1.2.7果蠅抗氧化基因的mRNA表達(dá)水平測定

第50天時收集各組果蠅至EP(eppendorf)管內(nèi)，用液氮快速冷凍后放置-80 ℃冰箱備用。利用熒光實(shí)時PCR檢測Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和Rnp11 mRNA的表達(dá)水平。所用的引物設(shè)計參考實(shí)驗(yàn)室先前發(fā)表文獻(xiàn)[11]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為多次測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。采用GraphPad Prism 5.0作圖和數(shù)據(jù)分析，用t檢驗(yàn)和單因素方差分析評價差異的顯著性，生存試驗(yàn)采用Log-Rank 檢驗(yàn)來評估壽命的顯著性。P<0.05 為差異性顯著，P<0.01 為差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米花青素對果蠅壽命的影響

按照1.2.2節(jié)的方法，通過飼喂果蠅一定劑量的黑米花青素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑米花青素在一定程度上可以延長果蠅的壽命，如圖1和表1所示，與對照組比，雄性果蠅BRA5組平均壽命從70 d延長到82 d，延長了17%(P<0.05)。雌性果蠅BRA5組與對照組相比平均壽命從75 d延長到了83 d，延長了11%(P<0.05)。黑米花青素對雄性和雌性果蠅的壽命延長有劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。本研究中黑米花青素對壽命影響的結(jié)果與先前報道的文獻(xiàn)結(jié)果一致，Peng等研究顯示藍(lán)莓花青素可以延長果蠅壽命10%[4]。因此，我們認(rèn)為黑米花青素和藍(lán)莓花青素對延緩衰老有相同的作用。BRA5組的延長壽命效果大于BRA1組，且考慮到衰老會受荷爾蒙的影響[9]，后期實(shí)驗(yàn)主要用雄性果蠅和5 mg/mL的劑量為研究對象。

表1 黑米花青素對果蠅壽命的影響

*P<0.05 為差異性顯著。

2.2 黑米花青素對果蠅進(jìn)食量和體重的影響

飲食限制被認(rèn)為有延長壽命的效果[12]，本研究為了排除飲食限制對壽命的影響，根據(jù)1.2.3節(jié)的方法測量了果蠅的體重，即果蠅在20 d和50 d時的體重。根據(jù)1.2.4節(jié)方法測定了果蠅的飲食攝入量，即在培養(yǎng)基中添加0.2%w(羅丹明B磺酸鈉鹽)，羅丹明B磺酸鈉鹽是一種遇酸顯紅的水溶性熒光染料，當(dāng)攝入羅丹明B磺酸鈉鹽的食物后，在果蠅腹部位置的紅色面積越大說明其飲食攝入量越大。結(jié)果如圖2所示，對照組和BRA5組的果蠅無論是在20 d時還是50 d時，其體重均無顯著差異(P>0.05)，飲食攝入量也無顯著差異(P>0.05)，說明黑米花青素對果蠅壽命的影響可以排除飲食限制對其的作用。

圖2 黑米花青素對果蠅體質(zhì)量和進(jìn)食量的影響Fig.2 Effect of black rice anthocyanin on body weight and redness index of Drosophila melanogaster

2.3 黑米花青素對果蠅運(yùn)動能力的影響

爬行實(shí)驗(yàn)是評估果蠅的運(yùn)動能力，主要是依據(jù)果蠅自身逆重力爬行的生理特性進(jìn)行的。Wang等研究紫薯提取物對果蠅壽命的影響時發(fā)現(xiàn)正常飲食和高脂飲食組果蠅逆重力爬行能力都顯著降低，當(dāng)喂食10 mg/mL的紫薯提取物時果蠅爬行能力顯著高于對照組[9]。如圖3所示，在第20天時，BRA5組和對照組的果蠅都很活躍，80%的果蠅都能快速爬到頂部，兩組之間無差異。當(dāng)喂養(yǎng)到第50天，進(jìn)入衰老期時，對照組只有10%的果蠅爬行超過4 cm，BRA5組有50%的果蠅能夠迅速爬到管頂部。BRA5組僅有27%的果蠅爬行不到2 cm高，同樣的情況下對照組有80%的果蠅爬行距離小于2 cm。因此，黑米花青素可以緩解衰老引起的運(yùn)動能力退化。

圖3 黑米花青素對果蠅爬行能力的影響Fig.3 Effect of black rice anthocyanin on climbing ability of Drosophila melanogaster

2.4 黑米花青素對果蠅腸道屏障功能的影響

隨著果蠅衰老，在腸道屏障功能上也會表現(xiàn)出紊亂，這可以通過藍(lán)精靈實(shí)驗(yàn)來檢測果蠅腸道的完整性。果蠅飼養(yǎng)到第20天和第50天時，通過在培養(yǎng)基里添加2.5%的藍(lán)色染料，喂養(yǎng)9 h，當(dāng)染料在消化道外被觀察到時，這只果蠅被認(rèn)為是“藍(lán)精靈”。如圖4所示，在20 d齡果蠅中，黑米花青素組與對照組的藍(lán)精靈的比例無差異。當(dāng)果蠅進(jìn)入衰老期50 d時，差異極顯著(P<0.01)，對照組的藍(lán)精靈比例達(dá)到了22%，而喂食黑米花青素組的比例僅有15%，可見，黑米花青素有保護(hù)腸道完整性的作用。

圖4 黑米花青素對果蠅腸道完整性的影響Fig.4 Effect of black rice anthocyanin on intestinal integrity of Drosophila melanogaster

所有后生動物腸道中都存在大量的微生物[13]，果蠅中腸區(qū)域中有5～10種微生物3.5×105個共生菌[14]。這些微生物失衡會導(dǎo)致疾病發(fā)生，需要激活抗菌天然免疫系統(tǒng)予以清除[15]。腸道干細(xì)胞(intestinal stem cells，ISCs)是果蠅腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)者，它可以通過不斷地進(jìn)行分裂和分化，調(diào)節(jié)新細(xì)胞的產(chǎn)生與凋亡細(xì)胞的清除之間的動態(tài)平衡，使果蠅腸道內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)定健康的狀態(tài)[16]。研究表明當(dāng)果蠅腸上皮細(xì)胞遭受氧化壓力、病原微生物的感染時，腸道干細(xì)胞會快速增殖來補(bǔ)充新的腸上皮細(xì)胞。但是在長期的應(yīng)激狀態(tài)下，腸道干細(xì)胞會過度增殖，分化形成腸下皮細(xì)胞，腸下皮細(xì)胞又會通過細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制分化成具有營養(yǎng)吸收功能的腸上皮細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的過度積累，會出現(xiàn)腸道的不完整性，甚至出現(xiàn)腸瘺現(xiàn)象[10]。本實(shí)驗(yàn)中花青素可以有效地抑制因衰老引起的腸道細(xì)胞內(nèi)紊亂，保持腸道的完整性。然而，黑米花青素對腸道干細(xì)胞增殖的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.5 黑米花青素對果蠅抗氧化基因mRNA表達(dá)水平的影響

熒光實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，以GAPDH為看家基因，與對照組相比，黑米花青素可以上調(diào)果蠅體內(nèi)的抗氧化酶mRNA表達(dá)水平，如：Mn-SOD(P<0.05)、Cu/Zn-SOD(P<0.01)、CAT(P<0.05)和Rpn11(P<0.05),如圖5所示。

* P<0.05為差異顯著，** P<0.01 為差異極顯著。圖5 黑米花青素對果蠅抗氧化基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of black rice anthocyanin on mRNA expression of anti-aging genes of Drosophila melanogaster

目前Harman的自由基理論認(rèn)為，生物體的衰老部分是由于活性氧(ROS)的積累，即羥自由基、超氧陰離子和過氧化氫，它們是有氧代謝的副產(chǎn)物。生物體有兩種抗氧化系統(tǒng)清除活性氧，第一個系統(tǒng)是由一組內(nèi)源性抗氧化酶組成，即超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)，另外一個體系是一組外源性抗氧化劑，如維生素C和維生素E，以最終消除ROS對生物體的影響。另外，各種生物標(biāo)志物檢查被廣泛用于氧化應(yīng)激、生理老化和年齡相關(guān)的疾病。去泛素化酶Rpn11基因可以抑制神經(jīng)性退行，敲出Rpn11后會導(dǎo)致泛素蛋白的積累，從而減少壽命[17]。本實(shí)驗(yàn)中黑米花青素顯著上調(diào)了果蠅體內(nèi)抗氧化基因的表達(dá)水平，延長了果蠅的平均壽命。Chiang等[18]研究了黑米花青素對HepG2細(xì)胞和C57BL/6小鼠氧化應(yīng)激能力，發(fā)現(xiàn)黑米花青素組的ROS顯著低于對照組， SOD和CAT酶活力顯著提高。本研究中黑米花青素顯著上調(diào)了果蠅體內(nèi)抗氧化基因(Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Cat)的表達(dá)水平，延長了果蠅的平均壽命。果蠅體內(nèi)Rpn11基因在喂食黑米花青素后也表達(dá)水平也顯著提升，Rpn11的高表達(dá)可以緩解衰老引起的26 S蛋白酶體活性降低，抑制衰老相關(guān)的神經(jīng)性退行疾病進(jìn)程。

3 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)中，以果蠅作為模型生物研究了黑米花青素對其壽命的影響。生存實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定劑量的黑米花青素飼喂果蠅后能延長其平均壽命和健康壽命。

運(yùn)動能力的退化是果蠅衰老的一個指標(biāo)，主要是依據(jù)果蠅自身逆重力爬行的生理特性進(jìn)行測定。在本試驗(yàn)中，在5 mg/mL黑米花青素培養(yǎng)基中飼喂50 d后，爬行距離大于4 cm的果蠅比例明顯大于對照組，說明黑米花青素能緩解衰老引起的運(yùn)動能力退化。

腸道屏障功能也是果蠅衰老的一個指標(biāo)。果蠅衰老后其腸道干細(xì)胞會異常增殖, 屏障功能降低, 因此腸道完整性下降, 通透性增加。在本試驗(yàn)中，飼喂5 mg/mL黑米花青素的藍(lán)精靈果蠅比例明顯低于對照組。可見，黑米花青素可有效抑制果蠅因衰老引起的腸道通透性，保護(hù)腸道的完整性。

飼喂一定劑量的黑米花青素可以延長果蠅的平均壽命和健康壽命，緩解因衰老引起的運(yùn)動能力降低。此外，黑米花青素可以通過影響抗氧化基因的表達(dá)水平增加抗氧化能力，保護(hù)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而延緩了果蠅的衰老。