水稻藤倉鐮孢菌對氰烯菌酯的抗藥性分析

張智慧，金 倩，王夏雯，王飛飛，王信海

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所，江蘇宿遷 223800）

水稻惡苗病又被稱為徒長病，是由藤倉鐮孢菌（Fusarium fujikuroi）侵染水稻引起的一種真菌種傳病害[1]，1828年日本首次報道，幾乎世界各水稻種植區(qū)均有發(fā)生。該病菌主要以帶菌種子及帶菌稻草越冬，在干燥條件下可存活2～3年。病谷長出的幼苗均為感病株，重者枯死，輕者菌絲體可擴展到整株，刺激莖葉徒長。田間病株產(chǎn)生分生孢子，經(jīng)風(fēng)雨傳播，從傷口侵入引起再侵染。抽穗揚花期，分生孢子傳播至花器上，侵入穎片和胚乳，造成秕谷或畸形，使種子帶菌，同時病菌還會產(chǎn)生付馬毒素等有毒代謝產(chǎn)物，影響種子質(zhì)量，嚴重的還可能造成食品安全問題。該病害在水稻秧苗期到抽穗期均可發(fā)生，一般導(dǎo)致水稻減產(chǎn)5%～20%，嚴重時可減產(chǎn)50%以上[2]。近年來，隨著稻草還田技術(shù)的推廣，田間菌源增多，同時由于缺乏抗病水稻品種，導(dǎo)致水稻惡苗病連年重發(fā)，嚴重影響水稻產(chǎn)量及質(zhì)量。

目前，通過化學(xué)藥劑對種子進行處理是防治水稻惡苗病的主要方式[3-4]。自20 世紀70年代以來，苯并咪唑類殺菌劑多菌靈開始在我國廣泛用于防治水稻惡苗病，具有較好防效。由于多菌靈作用位點單一，長期單一用藥極易使病菌產(chǎn)生抗藥性，已有報道表明，江蘇省藤倉鐮孢菌對多菌靈的抗藥性頻率高達92.3%[5]。20 世紀90年代中期，咪鮮胺用于替代多菌靈成為防治水稻惡苗病的主要藥劑[6]，同樣長期用藥易導(dǎo)致抗藥性發(fā)展迅速。已有報道表明，江蘇省藤倉鐮孢菌對咪鮮胺的抗性頻率達100%，江蘇省藤倉鐮孢菌對多菌靈及咪鮮胺具有雙重抗性的菌株所占比例高達58.42%[7-9]。目前，國內(nèi)登記用于防治水稻惡苗病的藥劑制劑中，85%的制劑有效成分為多菌靈、咪鮮胺或者咯菌腈。為有效治理藤倉鐮孢菌的抗藥性，新型殺菌劑氰烯菌酯替代多菌靈被用于防治水稻惡苗病。氰烯菌酯是由江蘇省農(nóng)藥研究所于1998年自主研發(fā)、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型殺菌劑。該藥劑屬于2-氰基丙烯酸酯類殺菌劑，具有專化性強、殺菌活性高的特點，同時具有保護和治療作用，可通過植物根部吸收，在葉片上有向上輸導(dǎo)性。

已有研究表明，氰烯菌酯作用于藤倉鐮孢菌肌球蛋白基因myosin5[10-11]。肌球蛋白（myosin）是一種馬達蛋白（motor protein），最早發(fā)現(xiàn)于肌肉組織，可作用于肌動蛋白絲（F-actin），把儲存于ATP的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C械能。肌球蛋白也廣泛存在于非肌細胞中，是細胞骨架的成分，參與細胞的吞噬、運動、受精和吸收等生理過程，充當(dāng)非肌細胞生命活動不同層次的調(diào)節(jié)者，從簡單的細胞間的信號傳遞到指導(dǎo)向化性遷移和細胞形狀的改變等較高級的調(diào)節(jié)。在藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）中，myosin5基因（FFUJ_01615）位于第一條核染色體上，開放閱讀框（ORF）全長3 802 bp，編碼1 267 aa，含有4個內(nèi)含子。

本研究以江蘇省宿遷地區(qū)水稻藤倉鐮孢菌為菌株，檢測對氰烯菌酯的抗藥性，明確其抗藥性基因型，為抗藥性治理及科學(xué)用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）是2018—2019年從江蘇省宿遷市采集的水稻惡苗病株上分離純化后得到的單孢菌株，共計86株，編號Sq1～Sq86。保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所分子實驗室。

1.2 供試藥劑與培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：200 g 土豆去皮均勻切成塊，煮沸10 min后過濾取汁。加入16 g 瓊脂粉，加熱至完全熔化。加入20 g 葡萄糖，用純水定容至1 L。125℃下濕熱滅菌25 min，常溫保存。

綠豆湯培養(yǎng)基（MBB 培養(yǎng)基）：30 g 綠豆煮到液體微紅，用純水定容至1 L，125℃下濕熱滅菌25 min，常溫保存。

95%氰烯菌酯原藥（phenamacril，由國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心江蘇基地提供）用甲醇配制成1×104μg/mL母液。

1.3 接種方法

將供試菌株分別接種到PDA 培養(yǎng)基，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其生長5 d 左右進行轉(zhuǎn)接。

1.4 供試菌株對多菌靈及氰烯菌酯最小抑制濃度（MIC）測定

分別測定86株藤倉鐮孢菌對氰烯菌酯的最小抑制濃度（MIC）。用直徑5 mm的打孔器在新鮮的供試菌株菌落邊緣打制菌餅。將供試藥劑母液與PDA培養(yǎng)基均勻混合，傾入直徑為90 mm 培養(yǎng)皿，將菌餅菌絲面朝上，均勻放置于含藥的PDA 平板上，每皿接種7個菌餅。25℃避光培養(yǎng)，5 d后測量菌落增長直徑。

1.5 氰烯菌酯對藤倉鐮孢菌生長的影響

采用菌絲生長速率測定法[12]，將供試菌株在PDA平板上于25℃預(yù)培養(yǎng)5 d后，用直徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣打制菌餅。將氰烯菌酯母液與PDA培養(yǎng)基均勻混合，氰烯菌酯濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、1.00、2.00 μg/mL，制成直徑為90 mm 平板，將菌餅菌絲面朝上放置于含系列濃度氰烯菌酯的平板中央，每皿接種一個菌餅，每處理3次重復(fù)。25℃黑暗培養(yǎng)，以無藥培養(yǎng)基為對照，5 d后，用十字交叉法測量菌落增長直徑。由菌落直徑平均值（mm）計算生長抑制率。

菌絲生長抑制率/%=[1-（藥劑處理的菌落直徑-5）（/對照菌落直徑-5）]×100

將菌絲生長抑制率轉(zhuǎn)換成概率值，藥劑濃度轉(zhuǎn)換成濃度對數(shù)，運用DPS軟件處理數(shù)據(jù)，計算出藥劑對各病原菌的毒力回歸方程Y=a+bX，有效抑制中濃度（EC50），相關(guān)系數(shù)（r）。

1.6 藤倉鐮孢菌生物學(xué)特性

菌絲生長速率測定：在無菌條件下，將活化后的供試菌株分別沿菌落邊緣外周1/3 處打成直徑為5 mm的菌餅，將菌餅置于PDA 平板中心位置，每皿接種一個菌餅，每處理重復(fù)3次。25℃避光培養(yǎng)5 d后，十字交叉法測量菌落直徑。

產(chǎn)孢能力測定：在無菌條件下，將活化后的供試菌株分別沿菌落邊緣，用直徑為5 mm的打孔器打制菌餅，放入裝有100 mL MBB 培養(yǎng)瓶。每瓶接種5個菌餅，25℃150 r/min 培養(yǎng)5 d。用血球計數(shù)板在顯微鏡下計算孢子數(shù)量，每處理3次重復(fù)。

1.7 藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）myosin5基因的克隆及序列分析

提取DNA：取適量待測菌株菌絲分別裝入1.5 mL離心管，加入700 μL的CTAB 提取緩沖液，加入石英砂，用研磨棒充分研磨后，60℃水浴加熱30 min。以12 000 r/min 離心10 min，取600 μL 上清液至1.5 mL 離心管中，加入等體積的氯仿，劇烈搖晃混勻30 s后，以12 000 r/min 離心10 min；取450 μL上清液，加入900 μL 無水乙醇，-20℃沉淀1 h，12 000 r/min 離心10 min；倒掉上清液，加入200 μL 70%乙醇，12 000 r/min 離心10 min；倒掉上清液，室溫下干燥5～15 min，溶于30 μL ddH2O，4℃冷藏備用[13]。

以測序菌株F.fujikuroi IMI58289 核基因組的myosin5基因（FFUJ_01615）序列為參考序列，進行myosin5基因的克隆。myosin5基因擴增引物序列（5′→3′）f1：ATCTTCTGATGCCCGTAT；f2：CAGTCGT CTCCAGCCACA。采用25 μL的PCR 擴增體系（表1）。PCR 反應(yīng)溫度參數(shù)為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸（每1 kb DNA 鏈長對應(yīng)0.5 min），共30個循環(huán)；72℃延伸15 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行觀察，回收產(chǎn)物送南京擎科生物科技有限公司測序。采用Bioedit 軟件進行序列比對分析。

表1 藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）myosin5基因擴增反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對氰烯菌酯最小抑制濃度（MIC）

為明確宿遷地區(qū)藤倉鐮孢菌對氰烯菌酯的抗藥性，分別測定了86株菌對氰烯菌酯的最小抑制濃度，結(jié)果表明，27株藤倉鐮孢菌（32%）對氰烯菌酯MIC=1 g/mL，59株藤倉鐮孢菌（68%）對氰烯菌酯MIC>5 g/mL（表2）。選取兩株抗藥性菌株（Sq6、Sq12）和兩株敏感菌株（Sq15、Sq20）供進一步研究。

2.2 氰烯菌酯對藤倉鐮孢菌的毒力

根據(jù)MIC 測定結(jié)果，選取供試菌株：Sq6、Sq12、Sq15 和Sq20，采用菌絲速率法，分別測定氰烯菌酯對其毒力。由表3可知，氰烯菌酯對Sq6 和Sq12的有效中濃度（EC50）分別為0.389 7 g/mL 和0.396 5 g/mL，顯著高于Sq15 和Sq20（0.169 7 g/mL，0.190 6 g/mL）。結(jié)合MIC 及EC50，表明菌株Sq6（MIC>5 g/mL，EC50=0.389 7 g/mL） 和Sq12（MIC>5 g/mL，EC50=0.396 5 g/mL）對氰烯菌酯具有抗藥性。

表2 供試藤倉鐮孢菌對氰烯菌酯的最小抑制濃度

表3 不同濃度氰烯菌酯對供試藤倉鐮孢菌的毒力

2.3 氰烯菌酯抗性菌株菌絲生長速率及產(chǎn)孢量測定

2.3.1 菌落生長速率 分別檢測氰烯菌酯抗性菌株（Sq6、Sq12）及敏感菌株（Sq15、Sq20）的菌落生長速率，結(jié)果表明，菌株Sq12 氣生菌絲貼近平板生長，菌落呈紫芋色。4株供試菌株間菌絲生長速率無顯著差異（表4、圖1）。

表4 藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）生長速率差異

2.3.2 產(chǎn)孢能力測定 采用MBB 培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)方法對氰烯菌酯抗性菌株（Sq6、Sq12）及敏感菌株（Sq15、Sq20）分生孢子產(chǎn)生能力進行測定。結(jié)果表明，菌株Sq12 和Sq20 產(chǎn)分生孢子能力分別為（37.36±2.11）×104個/mL，（39.50±1.86）×104個/mL，顯著高于Sq6[（31.26±0.86）×104個/mL]和Sq15[（30.06±0.91）×104個/mL]（表5）。

表5 供試藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）產(chǎn)分生孢子能力差異

2.4 藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）myosin5基因序列分析

為明確供試菌株抗性基因型，分別對供試氰烯菌酯抗性菌株（Sq6、Sq12）及敏感菌株（Sq15、Sq20）的myosin5基因進行測序，以測序菌株F.fujikuroi IMI58289為對照，比對分析表明，供試菌株Sq6 和Sq12 myosin5 第326位密碼子發(fā)生點突變，從AGG（精氨酸）→AGT（絲氨酸）；菌株Sq15 和Sq20 與對照相同，第326位密碼子未發(fā)生點突變（表6）。

表6 供試藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）myosin5基因的密碼子比對分析

3 討論與結(jié)論

藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）是一種種傳病害，但是其新形成的分生孢子能夠在同一個生長期引起更加嚴重的再侵染循環(huán)，因此，對于該病防控種子處理是關(guān)鍵措施。通過對86株野生供試菌株進行最小抑制濃度的測定，結(jié)果表明，宿遷地區(qū)32%藤倉鐮孢菌對氰烯菌酯MIC=1 g/mL，68%藤倉鐮孢菌對氰烯菌酯MIC>5 g/mL。從其中選取4株菌（Sq6、Sq12、Sq15、Sq20），測定氰烯菌酯對其有效中濃度（EC50），從而明確菌株Sq6、Sq12為氰烯菌酯抗性菌株，菌株Sq15、Sq20為氰烯菌酯敏感菌株。比較4株菌菌絲生長速率及產(chǎn)孢量，結(jié)果表明，氰烯菌酯抗性菌株與敏感菌株間菌絲生長速率不存在顯著差異，菌株Sq12 與Sq20 產(chǎn)孢量顯著高于Sq6 和Sq15。通過對myosin5基因序列比對分析，進一步明確氰烯菌酯抗性菌株（Sq6、Sq12）在326位密碼子由精氨酸突變?yōu)榻z氨酸（R326S）。

許多含有雜環(huán)的氰基丙烯酸酯類藥物對雜草[14]、昆蟲、病原真菌[15]、病毒[16]和癌癥[17]等具有優(yōu)異的抑制活性。在病原真菌中，禾谷鐮孢菌（F.graminearum）對氰烯菌酯抗藥性研究較為透徹。在禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中，共有3個基因編碼肌球蛋白，分別為：myosin5（FGSG_01410），myo2（FGSG_08719），myosin2B（FGSG_07469）。其中myosin5（FGSG_01410）點突變會使禾谷鐮刀菌對氰烯菌酯產(chǎn)生抗藥性：共涉及5個密碼子，分別為第216位、第217位、第418位、第420位和第786位密碼子[11]。

本研究中藤倉鐮孢菌（F.fujikuroi）對氰烯菌酯抗藥性表現(xiàn)基因型為：myosin5基因的第326位密碼子發(fā)生點突變，從AGG（精氨酸）→AGT（絲氨酸），發(fā)生在myosin5的馬達結(jié)構(gòu)域。已有研究報道，浙江省藤倉鐮孢菌對氰烯菌酯的抗藥性基因型為myosin5基因的第219位密碼子發(fā)生點突變，從TCA（絲氨酸）→CCA（脯氨酸）[10]。相比于宿遷地區(qū)采取稻麥輪作的耕作方式，浙江省采取一年兩熟的水稻生產(chǎn)方式，用藥頻次及累積用藥量高于宿遷地區(qū)。結(jié)合本研究結(jié)果，表明在不同的選擇壓（用藥頻次和用藥量）下，可導(dǎo)致不同的抗藥性突變基因型。因此，使用氰烯菌酯進行種子處理，需建立一個科學(xué)用藥方法，減少或者延緩田間抗藥性的產(chǎn)生。為延長氰烯菌酯使用壽命，是否可通過將其與不同作用機制的殺菌劑進行復(fù)配防治水稻惡苗病，有待進一步研究。