基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的連翹治療腎小球腎炎潛在靶點(diǎn)的研究

陳璟 聶銳 單鑫 陳靜 汪潔 呂志陽(yáng)

摘 要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究連翹治療腎小球腎炎潛在靶點(diǎn)。采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）按照口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18篩選出連翹的活性成分及其作用靶點(diǎn)，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)找出官方基因名稱。利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與腎小球腎炎相關(guān)的靶點(diǎn)基因。將活性成分所對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)與腎小球腎炎相關(guān)靶點(diǎn)基因交集，獲得兩者的共同基因即為連翹治療腎小球腎炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白質(zhì)互作關(guān)系，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)及ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析，進(jìn)而探究連翹治療腎小球腎炎的生物過(guò)程及作用通路。篩選得到連翹24個(gè)活性成分及478個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，其中與腎小球腎炎重復(fù)的有217個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)連翹防治腎小球腎炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路，推測(cè)該方劑對(duì)腎小球腎炎的潛在作用機(jī)制，為闡明中藥治療腎小球腎炎提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：連翹；腎小球腎炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；關(guān)鍵靶點(diǎn)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81073111，81374029，81874359）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20161371）；江蘇省高校自然基金（18KJB36011）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（18KJB310012）；2019江蘇省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（YB201997）

腎小球腎炎（acute glomerulonephritis，AGN）在臨床上為常見疾病之一，多數(shù)因?yàn)殒溓蚓推渌?xì)菌感染，其臨床表現(xiàn)為水腫、高血壓、血尿、蛋白尿。西醫(yī)一般會(huì)采用抗菌、抗感染、抗過(guò)敏等治療措施[1]，但是這些藥物會(huì)對(duì)腎臟造成巨大的毒副作用。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)看來(lái)，AGN的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，治療需要結(jié)合臨床單方驗(yàn)方及中成藥，臨床效果顯著。目前臨床在治療AGN時(shí)，主要采用攻補(bǔ)兼施的治法，虛多于實(shí)，則先補(bǔ)后攻。

在中醫(yī)的認(rèn)知中，AGN屬于“水腫”等陽(yáng)水范疇，其發(fā)病機(jī)制與外邪侵襲密切相關(guān)，致使肺、脾、腎三臟功能嚴(yán)重失調(diào)，水液代謝出現(xiàn)異常[2]?！夺t(yī)宗金鑒》所說(shuō)：“風(fēng)水得之，內(nèi)有水氣，外感風(fēng)邪；皮水得之，內(nèi)有水氣，皮受濕邪?！泵鞔魉脊А蹲C治要訣》曰：“有患實(shí)多于虛，則先攻后補(bǔ)。生瘡，用于瘡藥太早，致遍身腫。因此，治療AGN需要將利水除濕、祛風(fēng)清熱作為治療原則[3]。連翹可以疏散風(fēng)熱，清熱解毒，可以治療AGN所導(dǎo)致的熱毒。但是在一般研究中，都是將連翹用于麻黃連翹赤小豆湯作為整體治療AGN。本研究將單獨(dú)探索連翹治療AGN的潛在作用機(jī)制。

中藥的成分相當(dāng)復(fù)雜，以往的研究模式很難說(shuō)清其潛在作用機(jī)制。因而運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方式解析中藥及其復(fù)方中單一組分的分子作用機(jī)制。本研究以連翹為切入點(diǎn)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選連翹的活性成分及作用靶點(diǎn)，檢索已知的AGN相關(guān)靶點(diǎn)，利用用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）及ClueGo分析探究連翹治療AGN的潛在作用機(jī)制，為臨床治療AGN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 連翹活性成分的篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及技術(shù)平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database And Analysis Platform，TCMSP）篩選出已知的連翹活性成分?？梢赃x擇具有良好類藥性和毒藥物動(dòng)力學(xué)的吸收、分布、代謝和排泄（Absorption-Distribution-MetabolismExcretion，ADME）特征的化合物用于進(jìn)一步研究。連翹在臨床上一般用作湯劑，便于口服。按照口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-Like，DL）≥0.18進(jìn)行篩選得出連翹有效活性成分，記錄備用。

1.2 構(gòu)建有效活性成分-作用靶點(diǎn)

經(jīng)過(guò)TCMSP所得到的有效成分及其相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)找出相應(yīng)的官方基因名稱，篩選出人類的基因靶點(diǎn)名稱，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中，就得到了連翹有效成分—基因靶點(diǎn)。之后，利用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“藥物活性成分-基因靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中藥物的活性成分與其作用的靶點(diǎn)會(huì)形成一個(gè)節(jié)點(diǎn)，而藥物活性成分與其相應(yīng)靶點(diǎn)的連線則為節(jié)點(diǎn)的度值（Degree）。

1.3 AGN疾病靶點(diǎn)的收集

采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集AGN的疾病靶點(diǎn)，將數(shù)據(jù)收集到Excel中。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO注釋及KEGG通路福集

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析，將篩選條件設(shè)置為細(xì)胞的組成（cellular component）、分子的功能（molecular function）和生物的過(guò)程（biological process）3個(gè)篩選條件，點(diǎn)擊“Functional Annotation Table”，得到GO注釋結(jié)果。利用 Cytoscape 3.7.0 軟件中的ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG）通路分析，將關(guān)鍵作用靶點(diǎn)輸入到“GENES”一欄，選擇物種為人類，再設(shè)定P<0.05，選擇KEGG通路，最后點(diǎn)擊“start”開始分析，得到連翹對(duì)治療AGN的潛在作用通路。

2 結(jié)果

2.1 連翹-有效成分-靶點(diǎn)

通過(guò)TMCSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集24個(gè)有效成分及其516個(gè)基因靶點(diǎn)，最后得到477個(gè)有效基因靶點(diǎn)。用Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行可視化構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1）。其中按度值排名前10的有PTGS2、SCN5A、ADRB2、NCOA2、PTGS1、CALM、F10、KCNH2、HSP90、PPARG，這些靶點(diǎn)是連翹發(fā)揮作用的中藥靶點(diǎn)。

2.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物功能預(yù)測(cè)及作用通路分析

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析，通過(guò)ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析。網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)調(diào)控DNA重組，調(diào)節(jié)蘇氨酸激酶活性，激活MAPK活性，使其在血管生成、血管發(fā)育、核心啟動(dòng)特異性DNA結(jié)合的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。

采用Cytoscape中的插件ClueGO來(lái)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中在白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)通路、Cancer信號(hào)通路、Tuberculosis信號(hào)通路、Toll-like receptor等信號(hào)通路。

3 討論

AGN的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)代分子學(xué)研究表明，不同信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白、基因參與調(diào)控該疾病的發(fā)生與發(fā)展，相互作用機(jī)制復(fù)雜，單純通過(guò)使用“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”的藥物干預(yù)方式，很難改善AGN，臨床效果較差。所以本研究將目光轉(zhuǎn)移到傳統(tǒng)的中藥復(fù)方上。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)連翹進(jìn)行研究，最終找到了24個(gè)活性成分，預(yù)測(cè)了478個(gè)潛在靶點(diǎn)。在“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）等活性成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，槲皮素的活性較強(qiáng)，具有很好的抗炎作用，有效緩解AGN的發(fā)生發(fā)展。在對(duì)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)PTGS2、SCN5A等靶點(diǎn)可作用于多個(gè)活性成分，這體現(xiàn)了中藥多成分協(xié)同作用的特點(diǎn)。通過(guò)GeneCards平臺(tái)收集AGN相關(guān)靶點(diǎn)基因，與活性成分作用靶點(diǎn)取交集后最終獲得217個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。其中NOS2、CDK2、BAX、NF-kB、EGF、PTGS1、PIK3CG、KDR、PCNA、ELK1這10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)在治療疾病方面具有重要的作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅加深了研究人員對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還為治療這種疾病提供了新的策略。

在GO富集分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要通過(guò)調(diào)控DNA重組，調(diào)節(jié)蘇氨酸激酶活性，激活MAPK活性，使其在血管生成、血管發(fā)育、核心啟動(dòng)特異性DNA結(jié)合的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。在KEGG通路分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中作用在白細(xì)胞介素17（IL-17）、Cancer、Tuberculosis、Toll-like receptor等信號(hào)通路。這些通路主要在氧化應(yīng)激、炎癥等方面具有良好的作用，并且上述通路與目前相關(guān)研究結(jié)果具有一致性，證明本研究預(yù)測(cè)出的結(jié)果具有可靠性，主要表現(xiàn)在：（1）白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)通路：IL-17介導(dǎo)了一些炎性疾病，IL-17在腎臟中免疫復(fù)合物沉積后促進(jìn)AGN。（2）Toll樣受體信號(hào)通路：抑制Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)，這可能導(dǎo)致先天免疫反應(yīng)的損傷，是導(dǎo)致AGN的重要因素之一。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測(cè)連翹防治AGN的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路，推測(cè)該藥對(duì)疾病的潛在作用機(jī)制，可能主要參與抗炎、調(diào)節(jié)免疫及氧化應(yīng)激等過(guò)程，為闡明中藥治療AGN的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

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