基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的連翹治療腎小球腎炎潛在靶點的研究

陳璟 聶銳 單鑫 陳靜 汪潔 呂志陽

摘 要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法研究連翹治療腎小球腎炎潛在靶點。采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及技術(shù)平臺（TCMSP）按照口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18篩選出連翹的活性成分及其作用靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫找出官方基因名稱。利用Genecards數(shù)據(jù)庫檢索與腎小球腎炎相關(guān)的靶點基因。將活性成分所對應的基因靶點與腎小球腎炎相關(guān)靶點基因交集，獲得兩者的共同基因即為連翹治療腎小球腎炎的關(guān)鍵靶點。用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)。將關(guān)鍵靶點導入String數(shù)據(jù)庫獲得蛋白質(zhì)互作關(guān)系，結(jié)果導入Cytoscape軟件進行可視化。利用DAVID數(shù)據(jù)庫及ClueGo插件對關(guān)鍵作用靶點進行GO注釋分析和KEGG通路分析，進而探究連翹治療腎小球腎炎的生物過程及作用通路。篩選得到連翹24個活性成分及478個潛在作用靶點，其中與腎小球腎炎重復的有217個關(guān)鍵靶點。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預測連翹防治腎小球腎炎的關(guān)鍵靶點及其相關(guān)信號通路，推測該方劑對腎小球腎炎的潛在作用機制，為闡明中藥治療腎小球腎炎提供了科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞：連翹；腎小球腎炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學；關(guān)鍵靶點

基金項目：國家自然科學基金（81073111，81374029，81874359）；江蘇省自然科學基金（BK20161371）；江蘇省高校自然基金（18KJB36011）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（18KJB310012）；2019江蘇省中醫(yī)藥管理局項目（YB201997）

腎小球腎炎（acute glomerulonephritis，AGN）在臨床上為常見疾病之一，多數(shù)因為鏈球菌和其他細菌感染，其臨床表現(xiàn)為水腫、高血壓、血尿、蛋白尿。西醫(yī)一般會采用抗菌、抗感染、抗過敏等治療措施[1]，但是這些藥物會對腎臟造成巨大的毒副作用。在現(xiàn)代醫(yī)學看來，AGN的發(fā)病機制比較復雜，治療需要結(jié)合臨床單方驗方及中成藥，臨床效果顯著。目前臨床在治療AGN時，主要采用攻補兼施的治法，虛多于實，則先補后攻。

在中醫(yī)的認知中，AGN屬于“水腫”等陽水范疇，其發(fā)病機制與外邪侵襲密切相關(guān)，致使肺、脾、腎三臟功能嚴重失調(diào)，水液代謝出現(xiàn)異常[2]?！夺t(yī)宗金鑒》所說：“風水得之，內(nèi)有水氣，外感風邪；皮水得之，內(nèi)有水氣，皮受濕邪?！泵鞔魉脊А蹲C治要訣》曰：“有患實多于虛，則先攻后補。生瘡，用于瘡藥太早，致遍身腫。因此，治療AGN需要將利水除濕、祛風清熱作為治療原則[3]。連翹可以疏散風熱，清熱解毒，可以治療AGN所導致的熱毒。但是在一般研究中，都是將連翹用于麻黃連翹赤小豆湯作為整體治療AGN。本研究將單獨探索連翹治療AGN的潛在作用機制。

中藥的成分相當復雜，以往的研究模式很難說清其潛在作用機制。因而運用網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方式解析中藥及其復方中單一組分的分子作用機制。本研究以連翹為切入點，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法篩選連翹的活性成分及作用靶點，檢索已知的AGN相關(guān)靶點，利用用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）及ClueGo分析探究連翹治療AGN的潛在作用機制，為臨床治療AGN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 連翹活性成分的篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及技術(shù)平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database And Analysis Platform，TCMSP）篩選出已知的連翹活性成分?？梢赃x擇具有良好類藥性和毒藥物動力學的吸收、分布、代謝和排泄（Absorption-Distribution-MetabolismExcretion，ADME）特征的化合物用于進一步研究。連翹在臨床上一般用作湯劑，便于口服。按照口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-Like，DL）≥0.18進行篩選得出連翹有效活性成分，記錄備用。

1.2 構(gòu)建有效活性成分-作用靶點

經(jīng)過TCMSP所得到的有效成分及其相關(guān)靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫找出相應的官方基因名稱，篩選出人類的基因靶點名稱，將數(shù)據(jù)導入Excel中，就得到了連翹有效成分—基因靶點。之后，利用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“藥物活性成分-基因靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，其中藥物的活性成分與其作用的靶點會形成一個節(jié)點，而藥物活性成分與其相應靶點的連線則為節(jié)點的度值（Degree）。

1.3 AGN疾病靶點的收集

采用GeneCards數(shù)據(jù)庫收集AGN的疾病靶點，將數(shù)據(jù)收集到Excel中。

1.4 關(guān)鍵靶點的GO注釋及KEGG通路福集

采用DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵作用靶點進行GO注釋分析，將篩選條件設(shè)置為細胞的組成（cellular component）、分子的功能（molecular function）和生物的過程（biological process）3個篩選條件，點擊“Functional Annotation Table”，得到GO注釋結(jié)果。利用 Cytoscape 3.7.0 軟件中的ClueGo插件對關(guān)鍵作用靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG）通路分析，將關(guān)鍵作用靶點輸入到“GENES”一欄，選擇物種為人類，再設(shè)定P<0.05，選擇KEGG通路，最后點擊“start”開始分析，得到連翹對治療AGN的潛在作用通路。

2 結(jié)果

2.1 連翹-有效成分-靶點

通過TMCSP數(shù)據(jù)庫收集24個有效成分及其516個基因靶點，最后得到477個有效基因靶點。用Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化構(gòu)建“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1）。其中按度值排名前10的有PTGS2、SCN5A、ADRB2、NCOA2、PTGS1、CALM、F10、KCNH2、HSP90、PPARG，這些靶點是連翹發(fā)揮作用的中藥靶點。

2.2 關(guān)鍵靶點的生物功能預測及作用通路分析

對關(guān)鍵靶點基因進行GO富集分析，通過ClueGo插件對關(guān)鍵靶點進行分析。網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點通過調(diào)控DNA重組，調(diào)節(jié)蘇氨酸激酶活性，激活MAPK活性，使其在血管生成、血管發(fā)育、核心啟動特異性DNA結(jié)合的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。

采用Cytoscape中的插件ClueGO來對關(guān)鍵靶點進行通路富集分析。關(guān)鍵靶點主要集中在白細胞介素17（IL-17）信號通路、Cancer信號通路、Tuberculosis信號通路、Toll-like receptor等信號通路。

3 討論

AGN的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)代分子學研究表明，不同信號通路及其相關(guān)蛋白、基因參與調(diào)控該疾病的發(fā)生與發(fā)展，相互作用機制復雜，單純通過使用“點對點”的藥物干預方式，很難改善AGN，臨床效果較差。所以本研究將目光轉(zhuǎn)移到傳統(tǒng)的中藥復方上。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對連翹進行研究，最終找到了24個活性成分，預測了478個潛在靶點。在“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）等活性成分可作用于多個靶點，槲皮素的活性較強，具有很好的抗炎作用，有效緩解AGN的發(fā)生發(fā)展。在對靶點的預測過程中，發(fā)現(xiàn)PTGS2、SCN5A等靶點可作用于多個活性成分，這體現(xiàn)了中藥多成分協(xié)同作用的特點。通過GeneCards平臺收集AGN相關(guān)靶點基因，與活性成分作用靶點取交集后最終獲得217個關(guān)鍵靶點基因。其中NOS2、CDK2、BAX、NF-kB、EGF、PTGS1、PIK3CG、KDR、PCNA、ELK1這10個關(guān)鍵靶點在治療疾病方面具有重要的作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅加深了研究人員對疾病發(fā)病機制的認識，還為治療這種疾病提供了新的策略。

在GO富集分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預測的關(guān)鍵靶點主要通過調(diào)控DNA重組，調(diào)節(jié)蘇氨酸激酶活性，激活MAPK活性，使其在血管生成、血管發(fā)育、核心啟動特異性DNA結(jié)合的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。在KEGG通路分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預測的關(guān)鍵靶點主要集中作用在白細胞介素17（IL-17）、Cancer、Tuberculosis、Toll-like receptor等信號通路。這些通路主要在氧化應激、炎癥等方面具有良好的作用，并且上述通路與目前相關(guān)研究結(jié)果具有一致性，證明本研究預測出的結(jié)果具有可靠性，主要表現(xiàn)在：（1）白細胞介素17（IL-17）信號通路：IL-17介導了一些炎性疾病，IL-17在腎臟中免疫復合物沉積后促進AGN。（2）Toll樣受體信號通路：抑制Toll樣受體信號傳導，這可能導致先天免疫反應的損傷，是導致AGN的重要因素之一。

4 結(jié)語

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學，預測連翹防治AGN的關(guān)鍵靶點及其相關(guān)信號通路，推測該藥對疾病的潛在作用機制，可能主要參與抗炎、調(diào)節(jié)免疫及氧化應激等過程，為闡明中藥治療AGN的作用機制提供了科學依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 劉陽.麻黃連翹赤小豆湯加減治療腎小球腎炎的臨床觀察[J].中國處方藥，2016（8）：99-100.

[2] 張新蓮.麻黃連翹赤小豆湯合當歸飲子加減治療慢性蕁麻疹療效觀察[J].實用中醫(yī)藥雜志，2017（6）：628-629.

[3] 王敏，李樹君.麻黃連翹赤小豆湯治療蕁麻疹臨床體會[J].實用中醫(yī)藥雜志，2016（11）：1136-1137.