一個抗咪唑乙煙酸長芒莧種群的發(fā)現(xiàn)

吉美靜　黃兆峰　崔海蘭　陳景超　于海燕　張金鵬　李香菊

摘要：以咪唑乙煙酸為靶標除草劑，就幾種莧屬雜草對咪唑乙煙酸的抗藥性進行研究。結(jié)果表明，供試皺果莧、反枝莧和其中的一個長芒莧P1種群（北京種群）對咪唑乙煙酸比較敏感，而在長芒莧中發(fā)現(xiàn)一個對咪唑乙煙酸有抗藥性的P2種群（山東種群），在4倍推薦劑量下仍能全部存活。分子檢測發(fā)現(xiàn)該種群ALS基因的第574位和第653位氨基酸發(fā)生了單堿基突變，分別為色氨酸（Trp）突變?yōu)榱涟彼幔↙eu）、絲氨酸（Ser）突變?yōu)樘於彼幔ˋsp），種群中上述2種突變類型所占比例分別為38.9%、58.3%，2.8%的植株未檢測到突變。

關(guān)鍵詞：莧屬雜草;長芒莧;咪唑乙煙酸;抗性種群;ALS基因突變

中圖分類號：S451.2 文獻標志碼：A 文章編號：1003-935X（2020）03-0023-05

A New Imazethapyr-Resistant Population of Amaranthus palmeri

JI Mei-jing， HUANG Zhao-feng， CUI Hai-lan， CHEN Jing-chao， YU Hai-yan， ZHANG Jin-peng，LI Xiang-ju

（Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

Abstract：The resistance of several Amaranthus weeds to imazethapyr used as the target herbicide was studied.The result showed that the populations of A. retroflexus and A. viridis and P1 population of A. palmeri （Beijing population） were sensitive to imazethapyr，while a new imazethapyr-resistant P2 population of A. palmeri （Shandong population） was dicoveried. And this P2 population were still survived at 4 times recommended dose of imazethapyr. The molecular detection result showed that there were single nucleotide changes in Trp574 and Ser653 of ALS gene in this population （Trp-Leu and Ser-Asp）， respectively. The proportion of two mutations accounted for 38.9% and 58.3% in the P2 population， while no mutation was found in 2.8% of the detected gene sequence.

Key words：Amaranthus palmeri; imazethapyr;herbicide resistant population;ALS gene mutation

雜草抗藥性已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全的世界性難題之一。早在20世紀50年代，美國和加拿大就先后發(fā)現(xiàn)竹節(jié)菜（Commelina diffusa）和野胡蘿卜（Daucus carota）對2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）產(chǎn)生抗性[1-2];1970年，華盛頓西部發(fā)現(xiàn)北千里光（Senecio dubitabilis）對莠去津產(chǎn)生抗藥性[1]。隨著除草劑的大范圍應用，抗性雜草報道逐年增加[3-4]。國際抗性雜草數(shù)據(jù)庫（International Herbicide-Resistant Weed Database）中的數(shù)據(jù)顯示，截至2020年11月在其網(wǎng)站上登記的抗性雜草有262種，包括雙子葉雜草152種和單子葉雜草110種，共514個抗性生物型（species×site of action）。其中，對乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗藥性的雜草有165種，居第1位，涉及莧科、菊科、藜科、蓼科、十字花科、石竹科、千屈菜科、澤瀉科、旋花科、雨久花科、禾本科、莎草科等植物。莧科雜草對ALS抑制劑產(chǎn)生抗性的較多，僅莧屬就有北美莧（Amaranthus blitoides）、凹頭莧（A. blitum）、綠穗莧（A. hybridus）、長芒莧（A. palmeri）、鮑氏莧（A. powellii）、反枝莧（A. retroflexus）、刺莧（A. spinosus）、糙果莧（A. tuberculatus）、皺果莧（A. viridis）等9種抗性雜草[1]。

長芒莧（A. palmeri）是一年生莧科莧屬雜草，雌雄異株，原產(chǎn)于墨西哥西北部和美國的南加州至新墨西哥州到得克薩斯州一帶，后入侵至世界各地，現(xiàn)歐洲、大洋洲、亞洲等地均有分布[5-6]。我國1985年首次在北京市豐臺區(qū)南苑鄉(xiāng)發(fā)現(xiàn)長芒莧[7-8]，目前上海、安徽、江西、福建、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、遼寧、江蘇、浙江、河北、北京等地均有長芒莧分布的報道。長芒莧植株生長迅速、適應性強、繁殖系數(shù)高，對生境中的其他植物及農(nóng)作物生長構(gòu)成嚴重威脅。據(jù)報道，長芒莧在美國玉米、大豆、甘薯、花生、高粱、棉花等田中均有不同程度的危害，密度為0.11～10.5株/m2時，導致上述作物減產(chǎn)6%～91%[6]。長芒莧對除草劑的抗性嚴重，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對氟樂靈、莠去津、草甘膦、ALS抑制劑（滅草喹、氯嘧磺隆、嘧草硫醚等）、對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（HPPD）抑制劑（硝磺草酮）等產(chǎn)生抗性及多抗性，其中以ALS抑制劑抗性較為普遍。長芒莧被我國列為入侵性雜草[5]，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境有較大危害，一旦產(chǎn)生抗性將加劇其危害程度及治理難度。

基于農(nóng)田雜草抗性監(jiān)測工作的需要，我們就幾種莧屬雜草對ALS抑制劑的抗性進行例行監(jiān)測。在以咪唑啉酮類除草劑咪唑乙煙酸為靶標藥劑進行監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)，受試種群中一個長芒莧種群對咪唑乙煙酸產(chǎn)生了抗性。因此，本研究對莧屬4個不同種群對咪唑乙煙酸的抗性計量進行測定，并對不同種群的ALS靶點基因進行檢測，分析ALS靶點基因突變與植株存活的關(guān)系，以期明確ALS靶點基因突變是否會導致植株產(chǎn)生抗藥性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

莧屬雜草種子：反枝莧、皺果莧、長芒莧等4個種群（其中長芒莧種群2個，分別為P1和P2）的種子，分別采自河北省廊坊市、黑龍江省黑河市、北京市昌平區(qū)（P1）和山東省濰坊市（P2）。

供試藥劑及試劑：5%咪唑乙煙酸水劑，山東先達農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn);植物基因組DNA提取試劑盒、2×Pfu PCR Master Mix，購自天根生化科技（北京）有限公司;Trans2K DNA marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

儀器設備：ASS-4型行走式噴霧塔，Tee Jet8003扇形噴頭，由國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心研制;PCR儀，型號為AG-22331，購自德國Eppendorf公司;低溫離心機，型號為Centrifuge 5417R，購自德國Eppendorf公司;全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，型號為Tanon1600，購自上海天能科技有限公司;電泳槽，型號為JYC600C，購自北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試材料培養(yǎng) 本試驗于2020年6—8月進行，采用盆栽法培養(yǎng)供試莧屬雜草幼苗。于直徑為9 cm的盆缽中分別種植上述供試雜草種子，每盆撒播20粒，覆土1 cm。將盆缽放入裝有水的托盤中，以盆缽底部滲灌方式澆水，每隔3 d澆水1次，保持土壤濕度。盆缽置于自然光照網(wǎng)室大棚內(nèi)培養(yǎng)，溫度為25～35 ℃。幼苗長至2～3葉期進行間苗，每盆保留6株分布均勻、長勢基本一致的雜草幼苗待用。

1.2.2 不同莧屬種群對除草劑抗性劑量的測定 于雜草4～5葉期，采用ASS-4型行走式噴霧塔噴施除草劑咪唑乙煙酸，噴霧壓力為 0.275 MPa，噴液量為367.5 L/hm2。分別設置清水對照（CK）、75（即登記的推薦劑量，記為X）、150（記為2X）、300 g a.i. /hm2（記為4X）等4個處理。每個處理重復3次。施藥后 21 d，目測觀察植株長勢及株高;調(diào)查植株存活數(shù)，植株有綠色組織，則視為存活。

1.2.3 不同莧屬種群ALS靶點基因的分子檢測 在所有試材噴施除草劑咪唑乙煙酸之前，對各種群每盆幼苗進行單株標記，并剪取所有處理單株倒2葉的部分葉片，放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于后續(xù)靶點基因的分子檢測。根據(jù)GenBank中反枝莧ALS基因的序列（登錄號：AF363369.1），設計引物（表1），擴增片段包括ALS基因保守區(qū)目前已報道的8個突變位點。其中，反枝莧ALS-1199F/R擴增片段長度為1199 bp，包括第574、第653、第654位等3個位點;反枝莧ALS-921F/R擴增片段長度為921 bp，包括第122、第197、第205、第376、第377位等5個位點，引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

采用植物基因組提取試劑盒提取上述幾種莧屬雜草葉片全基因組DNA，提取方法參照試劑盒說明書。PCR擴增反應25 μL體系：2×Pfu PCR Master Mix，12.5 μL;ddH2O，10.5 μL;上下游引物，各0.5 μL;DNA模板，1 μL。PCR程序參數(shù)設定：95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，53（反枝莧ALS-921F/R）/55（反枝莧ALS-1199F/R） ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán);72 ℃延伸 10 min。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

利用Excel軟件對不同種群莧屬雜草的存活情況進行統(tǒng)計分析;利用Seq Man軟件將測序后獲得的序列與其對應的GeneBank中ALS基因序列進行比對，尋找序列中8個被報道突變位點的差異性。

將單株分子檢測后的位點突變情況與植株存活程度進行比較，分析靶點突變和植株存活的對應關(guān)系，明確ALS靶點基因突變是否會導致植株產(chǎn)生抗藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同莧屬雜草對咪唑乙煙酸的抗性程度

噴施除草劑后目測觀察，噴施 75 g a.i./hm2 咪唑乙煙酸即可明顯抑制反枝莧、皺果莧和長芒莧P1種群植株生長。在2X劑量下，大部分反枝莧植株死亡，存活的植株也僅剩1～2張葉片，接近死亡;長芒莧P1種群（北京種群）的表現(xiàn)與反枝莧類似;皺果莧植株全部死亡。表明咪唑乙煙酸對上述3種雜草有較好的防治效果。但長芒莧P2種群（山東種群）在咪唑乙煙酸4X劑量下仍能正常生長，株高與空白對照幾乎無差別。

將施藥后21 d調(diào)查的不同種群植株存活情況列于表2。由表2可以看出，空白對照處理所有種群的植株均存活;在推薦劑量（X）、2X和4X劑量下，反枝莧種群存活率分別為38.89%、22.22%、0;皺果莧種群存活率分別為5.56%、0、0;長芒莧P1種群存活率分別為38.89%、16.67%、0。而長芒莧P2種群，除在2X推薦劑量下植株存活率為88.89%（18株受試植株僅2株死亡）外，在其他各處理下的存活率均為100%。結(jié)果表明，長芒莧P2種群對咪唑乙煙酸存在較高水平的抗性，而其他3個受試同屬種群對咪唑乙煙酸仍較敏感。

2.2 不同莧屬種群的靶點突變分子檢測結(jié)果

將不同莧屬種群測序后的ALS基因序列與GenBank中各種群的ALS基因序列對比后，發(fā)現(xiàn)長芒P2種群的ALS基因序列發(fā)生了氨基酸取代，突變類型有2種，分別為574位色氨酸（Trp）突變?yōu)榱涟彼幔↙eu）和653位絲氨酸（Ser）突變?yōu)樘於彼幔ˋsp），各突變類型檢出比例分別為38.9%、58.3%，2株植株未檢測到突變（表3）。反枝莧、皺果莧和長芒莧P1種群的ALS基因序列經(jīng)對比后，均未發(fā)現(xiàn)突變。

將單株分子檢測所測得差異性位點結(jié)果與“2.1”節(jié)中不同處理植株存活程度進行比對，發(fā)現(xiàn)P2種群中2株未檢測到靶標基因突變的植株即為2X處理劑量下2株死亡的長芒莧植株。進一步說明，該種群是由于基因突變才導致對咪唑乙煙酸產(chǎn)生抗性。

3 小結(jié)與討論

本研究通過不同莧屬種群對咪唑乙煙酸的抗性劑量測定試驗發(fā)現(xiàn)，反枝莧、皺果莧和長芒莧P1種群對咪唑乙煙酸都較為敏感，其ALS基因序列經(jīng)對比，均未發(fā)現(xiàn)基因突變。而長芒莧P2種群在2倍推薦劑量下大部分植株存活，對靶標位點的分子檢測后發(fā)現(xiàn)，長芒莧P2種群存活植株ALS基因發(fā)生了氨基酸取代。將分子檢測結(jié)果與不同處理植株存活程度進行比對發(fā)現(xiàn)，長芒莧P2種群中2株未檢測到靶標基因突變的植株即為2X處理劑量下2株死亡的長芒莧植株，表明長芒莧P2種群是由于基因突變才導致對咪唑乙煙酸產(chǎn)生抗性。

雜草抗藥性是當前全球雜草治理面臨的重要難題。我國目前對莧屬雜草抗性的研究主要集中在反枝莧。如葛魯安等報道了玉米田中的反枝莧對煙嘧磺隆具有抗藥性，抗性倍數(shù)達13.7倍[9]，袁雪等報道，黑龍江一處大豆連作地的反枝莧對噻吩磺隆的抗性指數(shù)達66.17，產(chǎn)生了高水平抗性[10]。陳金奕等報道，黑龍江省嫩江縣和嫩北農(nóng)場的反枝莧種群對咪唑乙煙酸的抗性指數(shù)大于90，表現(xiàn)出高水平抗性[11]。在本研究中，反枝莧在2倍咪唑乙煙酸推薦劑量下，僅1～2株植株存活，皺果莧無存活植株，靶基因分子檢測后未發(fā)現(xiàn)上述2種雜草的靶基因突變，表明廊坊市反枝莧種群和黑河市受試皺果莧種群對咪唑乙煙酸基本無抗性。與上述莧屬種群不同的是，長芒莧P2種群對咪唑乙煙酸產(chǎn)生靶標抗性。長芒莧在我國被列為入侵性雜草，目前尚無抗性研究報道。其抗性基因的擴散蔓延以及可能與其他同屬植物雜交導致的抗性基因漂移應引起重視。

化學除草劑的長期選擇性壓力，導致雜草對多種除草劑產(chǎn)生了交互抗性和多抗性[4，6]。1997年美國發(fā)現(xiàn)對咪唑乙酸產(chǎn)生高水平抗性的長芒莧，抗性指數(shù)達2 800[12];長芒莧目前也被列為美國棉花田、大豆田十大難治雜草之一[6]。除此之外，近幾年，阿根廷[13]、巴西[14]、西班牙[15]等國家也相繼報道了抗ALS抑制劑的長芒莧生物型。

在本研究中，我們采用劑量測定與靶基因突變分子檢測同步進行的手段，快速發(fā)現(xiàn)了1種對咪唑乙煙酸產(chǎn)生抗性的長芒莧種群，從初篩結(jié)果來看，該種群抗性水平及抗性頻率均較高，有必要設計多個劑量梯度進一步測定抗性指數(shù)以及進行多抗及交互抗性研究。

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收稿日期：2020-09-15

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項（編號：CARS-25）。

作者簡介：吉美靜和黃兆峰為本文共同第一作者。

通信作者：李香菊，博士，研究員，主要從事農(nóng)田雜草生態(tài)與防除研究。E-mail：xjli@ippcaas.cn。