邵京 姜童譽(yù) 趙樂涵 趙艷霞 胡雪寅 谷宇欣 劉宴輔 李志成
摘 要:為研究冷藏成熟過程中雞肉新鮮度和嫩度與肽含量的關(guān)系,以剛屠宰的雞胸肉為研究對象,探究宰后雞肉常規(guī)冷卻與快速冷卻過程中的肽含量與其感官評分、新鮮度和嫩度的相關(guān)性。結(jié)果表明:雞肉中肽含量隨冷藏時(shí)間的延長先下降后上升,在冷藏0.5 d時(shí)達(dá)到最低值,冷藏3 d后逐漸上升,且常規(guī)冷卻組雞肉肽含量極顯著高于快速冷卻組(P<0.01);雞肉中總游離氨基酸含量與肽含量變化趨勢相反;冷藏0.5 d后,隨著冷藏時(shí)間的延長,雞肉中肽含量與pH值、菌落總數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量同步上升,而剪切力及感官評分逐漸降低??焖倮鋮s能夠延長成熟的時(shí)間,有利于雞肉貯藏保鮮。冷藏期間,2 組雞肉中的肽含量與菌落總數(shù)、pH值和TVB-N含量呈顯著或極顯著正相關(guān)(P<0.05、P<0.01),肽含量可用于評價(jià)雞肉的新鮮度。
關(guān)鍵詞:雞肉;肽含量;新鮮度;冷藏;相關(guān)性
Abstract: In order to study the correlation between chicken meat freshness and tenderness and its peptide content during postmortem aging and refrigerated storage, changes in the peptide content, sensory evaluation score, freshness indexes and tenderness of fresh chicken breast during refrigerated storage after conventional cooling and rapid cooling were investigated. The results showed that the peptide content in chicken meat decreased first and then increased with refrigeration time, which reached its minimum value on day 0.5 of refrigerated storage, and gradually decreased from day 3 onward. The peptide content in the conventional cooling group was significantly higher than that in the rapid cooling group (P < 0.05). The total content of free amino acids changed in a manner opposite to peptide content. The peptide content, pH, total bacterial count and total volatile basic nitrogen (TVB-N) content increased synchronously while the sensory evaluation score and shear force value decreased with increasing refrigeration time. Rapid cooling could prolong the aging time of chicken meat, being beneficial to quality preservation during storage. For both groups, there was a significant positive correlation (P < 0.05 or P < 0.01) of peptide content with total bacterial count, pH value and TVB-N content, indicating that peptide content can be considered as a chicken meat freshness index.
Keywords: chicken; peptide content; freshness; refrigerated storage; correlation
DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20200827-209
中圖分類號(hào):TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1001-8123(2020)11-0058-07
我國雞肉消費(fèi)量占肉類消費(fèi)量20%以上[1]。相比于豬肉、牛肉等其他肉品,雞肉質(zhì)地細(xì)嫩,含有豐富的蛋白質(zhì)且易被人體消化吸收,深受消費(fèi)者的喜愛。動(dòng)物宰后肌肉會(huì)發(fā)生多種不同反應(yīng),肉品中的化學(xué)成分和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化[2]。在成熟和冷藏過程中蛋白質(zhì)脫水、變性、降解以及脂肪的氧化酸敗等都會(huì)直接影響肉制品的品質(zhì),長時(shí)間貯藏會(huì)使肉品質(zhì)大幅度下降[3]。
冷鮮肉是我國居民肉品消費(fèi)的一個(gè)重要類別,因其安全、營養(yǎng)且衛(wèi)生的特點(diǎn)成為眾多消費(fèi)者的首選[4]。不同的冷卻方式不僅會(huì)影響肉類品質(zhì),也會(huì)影響企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[5]。傳統(tǒng)的冷卻方式雖然可以使胴體中心溫度降低至4 ℃[6],但容易造成胴體質(zhì)量的嚴(yán)重?fù)p失。而快速冷卻能將處于僵直前期的胴體溫度迅速降低至0 ℃或-1 ℃,該冷卻方式能更好地抑制微生物生長,降低胴體干耗,縮短胴體冷卻時(shí)間,增加產(chǎn)品出轉(zhuǎn)率,并有利于保持肉品嫩度[7]。
當(dāng)雞肉中的蛋白質(zhì)水解成肽類或游離氨基酸時(shí),其營養(yǎng)成分更容易被人體吸收[8]。肽類是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)[9]。同時(shí),幾乎所有的細(xì)胞也都受肽類調(diào)節(jié),細(xì)胞分化、神經(jīng)激素、遞質(zhì)調(diào)節(jié)、腫瘤病變、免疫調(diào)節(jié)等均與多肽密切相關(guān)[10]。近些年許多具有重要生物活性的肽類不斷被發(fā)現(xiàn),原有的肽類也不斷被發(fā)掘出新的生物功能[11]。肽類還具有食用及藥用的價(jià)值,作為食品功能因子的開發(fā)具有廣闊的利用前景。
目前,有關(guān)冷鮮肉的研究主要集中在嫩度和延長產(chǎn)品貨架期方面,各類肉品在宰后成熟及貯藏過程中的肽類變化情況尚不清楚。因此,本研究以雞肉為對象,通過測定雞肉的新鮮度(菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量、pH值和感官評分)、肽類和總游離氨基酸含量及肌纖維結(jié)構(gòu)等指標(biāo),研究冷藏期間雞肉肽類及品質(zhì)指標(biāo)的變化,闡明肽含量與雞肉新鮮度和嫩度間的關(guān)系,為豐富畜禽肉僵直成熟理論及成熟冷藏進(jìn)程的調(diào)控提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
新鮮雞胸肉 陜西石羊食品有限公司。
谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品 上海麥克林生化科技有限公司;甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)試劑 美國Sigma公司;氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇、鹽酸、硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑均為分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司;PB-10型pH計(jì) 德國Sartoris公司;L5可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;超凈工作臺(tái) 蘇州Airtech有限公司;TA.XT Plus物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司;H1650高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;SB-5200 DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;NH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;JYL-C020E料理機(jī) 九陽股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
將新鮮宰殺的雞胸肉分割成5 cm×5 cm×5 cm塊狀,放入無菌聚乙烯袋中,每袋100 g。隨機(jī)分為2 組:1)常規(guī)冷卻組:直接于4 ℃冰箱中冷藏;2)快速冷卻組:于-27 ℃快速冷卻30 min后于4 ℃冷藏。從開始冷藏即計(jì)算時(shí)間,2 組肉樣分別于冷藏0、0.5、1、3、5、7、9、11、13 d隨機(jī)取樣,進(jìn)行指標(biāo)測定,每組3 個(gè)平行。分析pH值、嫩度、TVB-N含量、菌落總數(shù)與肽含量的相關(guān)性[12-13]。其中,TVB-N含量、菌落總數(shù)測定和感官評價(jià)時(shí)冷藏0.5 d未取樣。
1.3.2 pH值測定
參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[14]中的方法進(jìn)行。
1.3.3 TVB-N含量測定
參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[15]中的方法進(jìn)行。
1.3.4 菌落總數(shù)測定
參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[16]中的方法進(jìn)行。
1.3.5 嫩度測定
參照NY/T 1180—2006《肉嫩度的測定 剪切力測定法》[17]中的方法進(jìn)行。
1.3.6 肽含量測定
參照饒青青等[18]的方法,取樣品0.5 g,加入1.5 mL蒸餾水用研缽研磨勻漿,取2 mL勻漿倒入10 mL離心管中,加入2.0 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液,混合均勻,靜置10 min,然后在10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min,吸取上清液0.5 mL轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中,并用5 g/100 mL三氯乙酸溶液定容至刻度,充分搖勻。取6.0 mL上述溶液于另一10 mL離心管中,加入雙縮脲試劑4.0 mL,靜置10 min,再次離心(10 000 r/min、4 ℃、15 min),取上清液于540 nm波長處測定吸光度。以還原性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到方程:y=0.368 1x+0.001 3(r=0.996 4)。將樣品溶液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中的多肽質(zhì)量濃度(mg/mL),進(jìn)而可求得樣品中多肽含量(mg/g)。
1.3.7 總游離氨基酸含量的測定
參照劉慧燕等[19]的方法,取2 g肉樣加入20 mL蒸餾水,沸水煮制10 min,冷卻過濾,收集濾液備用。取濾液1 mL于試管中,加入0.2 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液和茚三酮顯色劑各1 mL,再加入蒸餾水補(bǔ)齊總體積5 mL,搖勻,蓋塞,沸水浴中加熱15 min,取出,用冷水冷卻15 min,在568 nm波長處測定吸光度。以甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到方程:y=0.132 5x+0.141 9(r=0.999 5)。通過回歸方程計(jì)算樣品中的總游離氨基酸含量(mg/100 g)。
1.3.8 感官評價(jià)
將肉樣取出放至常溫,由10 位經(jīng)過培訓(xùn)的感官評價(jià)人員分別對雞胸肉的色澤、氣味、組織形態(tài)和肌肉彈性進(jìn)行評價(jià),具體評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。雞肉的綜合分值在17~20 分為新鮮,9~16 分為品質(zhì)良好,8 分以下為品質(zhì)發(fā)生明顯劣變[3]。
1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)
將樣品分割為3 mm×2 mm×1 mm的塊狀,放入體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中,于4 ℃下固定3 d,磷酸鹽緩沖液清洗后依次用不同體積分?jǐn)?shù)(30%、50%、70%、90%)乙醇溶液脫水2 h,再用無水乙醇脫水2 h,之后將樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。將干燥后的樣品粘在載物臺(tái)上進(jìn)行噴金處理,將噴金后樣品置于掃描電子顯微鏡下觀察[20]。
1.4 數(shù)據(jù)處理
所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 個(gè)重復(fù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Minitab 18.0和Excel 2017軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用單因素方差分析進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同冷卻方式雞肉冷藏過程中pH值的變化
pH值反映了樣品的新鮮度,當(dāng)pH值大于6.2時(shí)即認(rèn)為超出了一級(jí)新鮮度[21]。由圖1可知,冷藏0.5 d時(shí),常規(guī)、快速冷卻組雞肉的pH值均從5.8下降至5.7左右,之后隨冷藏時(shí)間的延長pH值逐漸升高,說明此時(shí)雞肉達(dá)到極限pH值。pH值作為判斷肌肉成熟進(jìn)程的重要指標(biāo)[22-23],當(dāng)達(dá)到極限pH值時(shí),胴體進(jìn)入宰后僵直最大化階段[24-26]。常規(guī)冷卻組樣品至冷藏6 d時(shí)已不新鮮,而快速冷卻組樣品在冷藏9 d時(shí)pH值超過6.2。冷藏1~13 d期間,2 組樣品pH值均存在顯著差異(P<0.01或P<0.05),說明快速冷卻降溫對新鮮雞肉品質(zhì)的保持具有顯著影響。
2.2 不同冷卻方式雞肉冷藏過程中TVB-N含量的變化
由圖2可知:2 種冷卻方式雞肉的TVB-N含量均在冷藏13 d內(nèi)逐漸升高;對比分析發(fā)現(xiàn),常規(guī)冷卻組雞肉TVB-N含量始終高于快速冷卻組,且在冷藏末期(11~13 d)差異極顯著(P<0.01)。常規(guī)冷卻組雞肉TVB-N含量在冷藏3 d后顯著上升(P<0.05),在冷藏7 d后超過一級(jí)鮮度規(guī)定的限值(15 mg/100 g)[13]。快速冷卻組雞肉在冷藏5 d后TVB-N含量增長較快,冷藏10 d后樣品變?yōu)椴恍迈r,說明以TVB-N含量為指標(biāo),快速冷卻能夠使雞肉保鮮期延長3 d。
2.3 不同冷卻方式雞肉冷藏過程中菌落總數(shù)的變化
由圖3可知:2 種冷卻方式雞肉在冷藏13 d期間菌落總數(shù)均呈上升趨勢;2 組雞肉在僵直成熟初期菌落總數(shù)基本保持恒定;常規(guī)冷卻組雞肉在冷藏3 d后顯著上升(P<0.05),冷藏5~11 d保持較大增幅,且在冷藏5 d后常規(guī)冷卻組雞肉的菌落總數(shù)極顯著高于快速冷卻組雞肉(P<0.01),說明快速冷卻降溫對冷鮮肉的腐敗具有顯著抑制作用。雞肉中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),可作為多種腐敗微生物生長的天然培養(yǎng)基[27-28]。低溫冷藏可以抑制部分細(xì)菌的生長繁殖,但一些低溫菌仍可在肉品表面生長,使肉失去表面光澤,變得黏滑,甚至腐敗變質(zhì)[29]。而快速冷卻處理使雞肉中心溫度在較短時(shí)間內(nèi)降低到4 ℃,抑制了微生物的生長繁殖及向肉內(nèi)部侵染[30-31],因此快速冷卻組雞肉的菌落總數(shù)極顯著低于常規(guī)冷卻組。以菌落總數(shù)(≤6 (lg(CFU/g)))為指標(biāo)判定,與常規(guī)冷卻相比,快速冷卻能延長雞肉保鮮期5 d以上。
2.4 不同冷卻方式雞肉冷藏過程中感官評分的變化
由圖4可知,2 種冷卻方式雞肉在冷藏13 d期間感官評分均呈下降趨勢,且差異不顯著,表明冷卻方式的選擇對雞肉冷藏期間的感官評分影響較小。常規(guī)冷卻組雞肉感官評分快速下降,品質(zhì)劣變速率較快,在冷藏7 d時(shí)感官評分降低至12 分;快速冷卻組雞肉的感官評分在冷藏5 d后顯著下降(P<0.05)。2 組雞肉均在冷藏11 d時(shí)低于8 分,此時(shí)雞肉局部表面發(fā)黏、質(zhì)地松散、彈性差,接近腐敗變質(zhì)。
2.5 不同冷卻方式對雞肉冷藏過程中嫩度的影響
嫩度是決定畜禽肉食用品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,反映了肉中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性、肌肉中脂肪的分布狀況,一般用剪切力表示[32]。影響肉嫩度的因素除畜禽品種、基因型、性別和年齡等宰前生理因素外,還包括宰后肉的成熟時(shí)間和溫度、胴體吊掛方式、電刺激等物理化學(xué)因素[33-35]。
由圖5可知:2 種冷卻方式雞肉在冷藏13 d期間剪切力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢;在冷藏0.5 d時(shí)剪切力均達(dá)到最大值,這與此時(shí)雞肉達(dá)到極限pH值進(jìn)入最大僵直期的結(jié)果一致;之后剪切力快速下降(P<0.05),這可能由于雞肉達(dá)到最大僵直期后,開始解僵自溶,肌纖維斷裂為小片狀[33-35],使肌肉質(zhì)地變軟,剪切力變小,嫩度增加[35];冷藏5 d至結(jié)束雞肉剪切力緩慢下降??焖倮鋮s組雞肉在冷藏3、7 d和9 d時(shí)剪切力顯著高于常規(guī)冷卻組(P<0.05),可能是快速冷卻處理抑制內(nèi)源酶活性,延緩了內(nèi)源酶水解作用[36]。
2.6 不同冷卻方式雞肉冷藏過程中肽含量的變化
根據(jù)TVB-N含量、菌落總數(shù)和感官評價(jià)結(jié)果判斷,常規(guī)冷卻雞肉在冷藏7 d時(shí)已接近腐敗變質(zhì),因此,本實(shí)驗(yàn)僅對冷藏0~7 d期間雞肉的肽和總游離氨基酸含量進(jìn)行測定,用于分析雞肉冷藏成熟期間肽含量與新鮮度、嫩度的關(guān)系。由圖6可知,冷藏0.5 d時(shí)2 組樣品的肽含量均下降至最低,冷藏1~7 d雞肉中肽含量持續(xù)增加(P<0.05),常規(guī)冷卻組雞肉肽含量極顯著高于快速冷卻雞肉(P<0.01)。肉在成熟過程受到內(nèi)源性蛋白酶如鈣激活蛋白酶、組織蛋白酶L/B/H及外界微生物的共同影響,而快速冷卻處理抑制了內(nèi)源性和外源性蛋白酶的活性[34],從而抑制或減緩了雞肉中蛋白質(zhì)的降解,使快速冷卻組雞肉的肽含量遠(yuǎn)低于常規(guī)冷卻組。
2.7 不同冷卻方式雞肉冷藏過程中總游離氨基酸含量的變化
由圖7可知:2 種冷卻方式雞肉總游離氨基酸含量均在冷藏0.5 d時(shí)達(dá)到最高,常規(guī)冷卻和快速冷卻組雞肉分別為1 320.91 mg/100 g和1 144.44 mg/100 g,且二者差異顯著(P<0.05);之后2 組雞肉總游離氨基酸含量均呈緩慢下降趨勢,且常規(guī)冷卻組雞肉始終極顯著高于快速冷卻組雞肉(P<0.01),這與肽含量變化趨勢相反。這可能是因?yàn)槌R?guī)冷卻組雞肉中酶活性較高,對雞肉蛋白的降解程度也較高所致??傆坞x氨基酸含量隨冷藏時(shí)間的延長顯著下降,可能是游離氨基酸被微生物消耗或合成肽,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
2.8 不同冷卻方式雞肉冷藏過程中肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)的變化
由雞肉冷藏過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化(圖8)可知:新鮮雞肉切面平整,肌纖維排列整齊,大小均勻,結(jié)構(gòu)形態(tài)完整,纖維之間未觀察到明顯間隙;冷藏1 d,常規(guī)冷卻和快速冷卻組雞肉肌纖維呈現(xiàn)出不同程度的皺縮,纖維之間有分離現(xiàn)象,肌纖維的皺縮和分離可能是由于雞肉失水以及蛋白變性降解造成的[37-38];冷藏5 d時(shí),肌纖維表面降解嚴(yán)重、內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊,即隨冷藏時(shí)間的延長,蛋白骨架結(jié)構(gòu)的破壞程度加大,肌原纖維蛋白持水性降低,汁液流失嚴(yán)重。肌原纖維蛋白的降解導(dǎo)致雞肉微觀結(jié)構(gòu)變化,引起剪切力降低,肉嫩度增加。
2.9 肽含量與pH值、剪切力、TVB-N含量、菌落總數(shù)、感官評分的相關(guān)性
由表2可知,在常規(guī)冷卻條件下,雞肉的肽含量與pH值(P<0.01、r=0.976)、菌落總數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01、r=0.978)。肽含量與TVB-N含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05、r=0.948),與感官評分呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05、r=-0.950)。pH值與菌落總數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01、r=0.966),TVB-N含量與感官評分呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01、r=-0.997)。多數(shù)指標(biāo)與感官評分和剪切力之間均呈負(fù)相關(guān)。
由表3可知,在快速冷卻條件下,雞肉的肽含量與pH值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01、r=0.964),肽含量與菌落總數(shù)(P<0.05、r=0.950)、TVB-N含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05、r=0.958),pH值和菌落總數(shù)(P<0.05、r=0.906)、菌落總數(shù)與TVB-N含量(P<0.05、r=0.954)均呈顯著正相關(guān)。TVB-N含量和感官評分呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05、r=-0.937)。
為建立雞肉冷藏成熟過程中新鮮度和嫩度與肽含量的相關(guān)性,將肽含量與各指標(biāo)進(jìn)行回歸分析,求得雞肉常規(guī)冷卻與快速冷卻的回歸方程分別為:
y1=-153.00+21.30x1+8.04x2+1.29x3 (1)
y2=-146.90+29.07x1-4.37x2+1.27x3 (2)
式中:y1、y2分別表示常規(guī)冷卻和快速冷卻雞肉中的肽含量;x1為pH值;x2為菌落總數(shù);x3為TVB-N含量。
由多元回歸方程(1)、(2)可知,2 種冷卻方式雞肉中的肽含量均與其pH值、菌落總數(shù)和TVB-N含量呈顯著或極顯著正相關(guān)(P<0.01或P<0.05),說明肽含量可以用于評價(jià)雞肉的新鮮度,肽含量越高,雞肉的新鮮度越差。由此推論,肉中肽含量可作為評價(jià)畜禽肉新鮮度的指標(biāo)。
3 結(jié) 論
雞肉宰后冷藏成熟過程中肽含量在冷藏0.5 d時(shí)降至最低,之后逐漸升高,冷藏3 d至結(jié)束,常規(guī)冷卻組雞肉中的肽含量極顯著高于快速冷卻組(P<0.01)。而總游離氨基酸含量則在冷藏0.5 d時(shí)達(dá)到最大值,與肽含量變化趨勢相反。冷藏0.5 d后,隨著冷藏時(shí)間的延長,雞肉中肽含量與pH值、菌落總數(shù)以及TVB-N含量同步上升,剪切力與感官評分不斷降低。熱鮮肉快速冷卻能夠延長成熟時(shí)間,有利于雞肉的貯藏保鮮。冷藏期間2 組雞肉中的肽含量與菌落總數(shù)、pH值、TVB-N含量呈顯著或極顯著正相關(guān)(P<0.05或P<0.01),因此,肽含量可用于評價(jià)雞肉的新鮮度。本研究結(jié)果對豐富畜禽肉宰后僵直成熟理論、冷藏進(jìn)程的調(diào)控及其新鮮度評價(jià)方法的建立均具有重要意義。
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