前列腺癌組織中驅(qū)動蛋白5的表達(dá)及其與5年進(jìn)展和生化復(fù)發(fā)的關(guān)系

徐禮臻 朱再生 徐旻

近年來，我國前列腺癌發(fā)病人群日趨年輕化，但關(guān)于前列腺癌的病因仍未完全闡明。癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白5（kinesin-5，Eg5）基因存在于所有真核細(xì)胞中，具有ATP酶活性，在有絲分裂過程中對雙極軸的形成和維持起重要作用，參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1-2]，但它在前列腺癌中的作用尚未闡明。本研究對前列腺癌組織及前列腺增生組織中Eg5蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測與比較，同時(shí)分析了不同臨床病理特征的前列腺癌患者Eg5蛋白陽性表達(dá)率，還分析了Eg5蛋白表達(dá)陽性與陰性的前列腺癌患者累計(jì)5年進(jìn)展及生化復(fù)發(fā)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院2001至2011年手術(shù)治療的前列腺癌65例和前列腺增生38例患者的臨床資料和病理組織標(biāo)本。65例前列腺癌患者年齡 54～78（65.5±4.5）歲；Gleason 評分＜7 分 32 例，≥7分33例；按照2002年美國癌癥聯(lián)合委員會的TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期24例；術(shù)前均未接受過放化療和內(nèi)分泌治療。前列腺增生患者年齡53～79（66.2±4.3）歲。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 Eg5蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化SP法。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，使用SP試劑盒、DAB顯色劑（均購自北京中杉生物技術(shù)公司）進(jìn)行免疫組化染色，二甲苯脫蠟，依次梯度乙醇水化，加入兔抗人 Eg5 一抗（工作濃度 1：100，規(guī)格：100 μg，批號：abs7431），4 ℃孵育過夜，PBS洗 3次，5 min/次；滴加二抗（生物素標(biāo)記）室溫孵育0.5 h；PBS洗3次，5 min/次；DAB顯色、蘇木素復(fù)染，封片，在光鏡下觀察。使用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)褐色顆粒為陽性表達(dá)。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生參照Sulzers表達(dá)分級法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷：幾乎無陽性表達(dá)細(xì)胞為（-），陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜10%為（+），陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù) 10%～50%為（++），陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＞50%為（+++）；其中陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≥10%判定為陽性表達(dá)。

1.3 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) 臨床進(jìn)展是指影像學(xué)檢查提示局部病灶進(jìn)展及轉(zhuǎn)移灶數(shù)目增多；生化復(fù)發(fā)是指血清前列腺特異抗原水平升高，達(dá)到0.2 μg/L。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier曲線，采用log-rank法比較Eg5蛋白表達(dá)陽性與陰性的前列腺癌患者累計(jì)5年進(jìn)展率及生化復(fù)發(fā)率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺增生組織和前列腺癌組織Eg5蛋白表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果 Eg5主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核中表達(dá)較少；前列腺癌組織中Eg5表達(dá)高于前列腺增生組織，見圖1（插頁）。

圖1 前列腺增生組織和不同Gleason評分前列腺癌組織中驅(qū)動蛋白5（Eg5）蛋白表達(dá)（a：在前列腺增生組織中的表達(dá)；b：在Gleason評分7分的前列腺癌組織中的表達(dá)；c：在Gleason評分8分的前列腺癌組織中的表達(dá)；d：在Gleason評分9分的前列腺癌組織中的表達(dá)；免疫組化染色，×100）

2.2 前列腺增生組織與前列腺癌組織中Eg5蛋白陽性表達(dá)率比較 前列腺癌組織中Eg5蛋白陽性表達(dá)率為69.23%（45/65），明顯高于前列腺增生組織中的陽性表達(dá)率15.79%（6/38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=27.398，P＜0.05）。

2.3 不同臨床病理特征的前列腺癌患者癌組織中Eg5蛋白陽性表達(dá)率比較 不同Gleason評分、臨床分期以及有無5年進(jìn)展、5年生化復(fù)發(fā)的患者前列腺癌組織中Eg5蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中Gleason評分≥7分、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、5年進(jìn)展、5年生化復(fù)發(fā)的患者Eg5蛋白陽性表達(dá)率較高，見表1。

表1 不同臨床病理特征的前列腺癌患者癌組織中Eg5蛋白陽性表達(dá)率比較[例（%）]

2.4 Eg5蛋白表達(dá)陽性與陰性的前列腺癌患者累計(jì)5年進(jìn)展率及生化復(fù)發(fā)率比較 Eg5蛋白表達(dá)陽性患者累計(jì)5年進(jìn)展及生化復(fù)發(fā)率均明顯高于Eg5蛋白表達(dá)陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.969、4.924，均P＜0.05），見圖 2。

3 討論

圖2 驅(qū)動蛋白5（Eg5）蛋白表達(dá)陽性與陰性的前列腺癌患者累計(jì)5年進(jìn)展及5年生化復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier曲線

Eg5在細(xì)胞有絲分裂過程中起著重要作用[3]。Eg5是一個(gè)對腫瘤有潛在治療作用的靶點(diǎn)基因，體外研究表明抑制Eg5表達(dá)可抑制乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移[4-6]。由于Eg5抑制劑對ATP不具競爭性抑制，通過與遠(yuǎn)離ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而起變構(gòu)抑制劑的作用，不存在與ATP競爭性激酶抑制劑相同的作用機(jī)制[7-8]。因此，利用Eg5抑制劑可以明顯增強(qiáng)抑癌基因的作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)Eg5高表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤浸潤和腫瘤血管形成，其作用機(jī)制可能與Eg5可阻斷CD4+T細(xì)胞從而影響腫瘤細(xì)胞的周期，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和血管形成有關(guān)[9]。抑制Eg5后，多西紫杉醇的抗癌活性明顯增強(qiáng)，耐藥性降低。研究發(fā)現(xiàn)，Eg5抑制劑對激素難治性前列腺癌以紫杉醇為基礎(chǔ)的化療有明顯療效，與微管靶向藥物相比，可以增強(qiáng)紫杉醇療效且降低其毒性[10]。雖然Eg5基因異常表達(dá)對腫瘤的作用機(jī)制至今尚未清楚，但有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示具有E3泛素連接酶活性的Parkin蛋白對Hsp70-JNK-c-Jun信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，Parkin可催化Hsp70泛素化，造成蛋白激酶JNK活性喪失，使c-Jun無法與Eg5啟動子AP1位點(diǎn)結(jié)合，從而下調(diào)Eg5基因表達(dá)[11]。因?yàn)镋g5在神經(jīng)細(xì)胞中不表達(dá)，Eg5抑制劑較多西紫杉醇毒副反應(yīng)更小，耐藥性更低[12]?？梢?，Eg5抑制劑在前列腺癌中有更廣闊的應(yīng)用前景。本研究對Eg5在前列腺癌中的作用方式及作用機(jī)制進(jìn)行研究，具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，Eg5是細(xì)胞有絲分裂周期中一個(gè)重要的驅(qū)動蛋白，在細(xì)胞質(zhì)分裂中紡錘體形成、定位、染色體分離中起重要作用。Liu等[13]采用qPCR法對肝癌組織及癌周正常組織進(jìn)行Eg5表達(dá)檢測與比較，同時(shí)對肝癌組織進(jìn)行免疫組化分析，探討Eg5表達(dá)與肝癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示Eg5 mRNA和蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌周正常組織（P＜0.05），同時(shí)Eg5蛋白表達(dá)與肝硬化（P=0.038）和肝癌TNM分期（P=0.008）密切相關(guān)；Kaplan-Meier生存曲線分析顯示Eg5蛋白表達(dá)與肝硬化（P=0.000）和肝癌TNM分期（P=0.025）密切相關(guān)；Cox回歸模型分析顯示Eg5表達(dá)是預(yù)測肝癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.001）。陳杰勛等[14]對Eg5在膀胱癌中的表達(dá)進(jìn)行了研究，通過靶向干擾Eg5基因?qū)Π螂装㏕24細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)靶向干擾Eg5基因后，T24細(xì)胞增殖和遷移明顯被抑制，T24細(xì)胞凋亡增加。國外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Eg5在腫瘤中的作用機(jī)制與作用于腫瘤細(xì)胞遷移和血管生成有關(guān)，其機(jī)制可能是參與了免疫調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)翻譯過程；在前列腺癌PC-3細(xì)胞中應(yīng)用Eg5抑制劑K858（1,3,4-噻二唑啉類似物、驅(qū)動蛋白Eg5抑制劑）可以抑制PC-3細(xì)胞生長，G2/M細(xì)胞周期受到阻滯[15]。本研究采用免疫組化染色法檢測了前列腺癌組織與前列腺增生組織中Eg5蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示前列腺癌組織中Eg5蛋白表達(dá)陽性率明顯高于前列腺增生組織；分析不同臨床病理特征的前列腺癌患者癌組織中Eg5蛋白陽性表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)Gleason評分≥7分、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、5年進(jìn)展、5年生化復(fù)發(fā)的患者Eg5蛋白陽性表達(dá)率較高。進(jìn)一步繪制Kaplan-Meier曲線，發(fā)現(xiàn)Eg5蛋白表達(dá)陽性患者累計(jì)5年進(jìn)展及生化復(fù)發(fā)率均明顯高于Eg5蛋白表達(dá)陰性患者，表明Eg5在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

綜上所述，前列腺癌組織中Eg5蛋白呈高表達(dá)，其表達(dá)與前列腺癌Gleason評分、臨床分期、5年臨床進(jìn)展和5年生化復(fù)發(fā)有關(guān)。然而，其確切機(jī)制尚未闡明，今后可從細(xì)胞學(xué)水平系統(tǒng)研究Eg5在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及作用機(jī)制，為前列腺癌的治療探尋新途徑。