外泌體與肺纖維化相關(guān)的研究進(jìn)展

劉永駿，李婷，董昭興

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，昆明 650101)

肺纖維化是嚴(yán)重影響人類呼吸功能的疾病，其發(fā)病機(jī)制為各種原因所致肺泡上皮細(xì)胞的反復(fù)損傷、應(yīng)激、凋亡，成纖維細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化激活，肺基質(zhì)逐漸破壞，導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的活化和積累，同時(shí)肺泡上皮細(xì)胞不能進(jìn)行正常的修復(fù)重建，最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[1]。目前，尚無(wú)特效的肺纖維化治療藥物，特發(fā)性纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)確診患者的平均生存周期僅3～5年[2]。新型抗纖維化藥物(吡非尼酮和尼達(dá)尼布)可減緩患者用力肺活量的下降，但不能控制肺纖維化的進(jìn)展，也不能逆轉(zhuǎn)現(xiàn)有的肺纖維化[3]。

外泌體是由內(nèi)體膜向內(nèi)凹陷形成的直徑為30～150 nm的細(xì)胞微囊泡，外泌體與質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外空間[4]。20世紀(jì)80年代后期，細(xì)胞外有外泌體存在被確定[5]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是一種參與細(xì)胞間通訊的功能性載體[6]。外泌體廣泛存在于體液中，包括血液、尿液、唾液、羊水、支氣管肺泡灌洗液、母乳等[7]，可在心臟[8]、腎臟[9]、腹膜[10]等器官纖維化的發(fā)生過(guò)程及調(diào)節(jié)機(jī)制中起重要作用。現(xiàn)就外泌體與肺纖維化的關(guān)系予以綜述。

1 外泌體概述

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)是由細(xì)胞分化、活化、衰老、轉(zhuǎn)化等多種刺激誘導(dǎo)的一種膜囊泡，包括外泌體、凋亡小體、微囊泡，而外泌體是唯一已知的源自內(nèi)膜的分泌細(xì)胞囊泡，是由多泡體向胞內(nèi)出芽產(chǎn)生靶向質(zhì)膜的腔內(nèi)囊泡，其過(guò)程目前尚未完全清楚，可能與轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合物途徑、神經(jīng)酰胺依賴性途徑有關(guān)[4,6]。

外泌體由脂質(zhì)雙層膜形成，其中包含蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)及其衍生物等。外泌體所含蛋白質(zhì)包括腔內(nèi)蛋白質(zhì)和跨膜蛋白，如熱激蛋白、四跨膜蛋白等，其中四跨膜蛋白，特別是白細(xì)胞分化抗原63和白細(xì)胞分化抗原81是常用的特異性外泌體標(biāo)志物[4,6,11]。外泌體中含有的核酸包括信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA)以及長(zhǎng)非編碼RNA、環(huán)狀RNA、循環(huán)DNA、線粒體DNA，在人血漿來(lái)源的外泌體RNA中miRNAs最豐富。研究表明，外泌體中的核酸參與了許多疾病過(guò)程，如腫瘤、心血管疾病、自身免疫疾病等[6,12]。外泌體富含的脂質(zhì)主要包括膽固醇、鞘糖脂、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、花生四烯酸和其他脂肪酸、前列腺素和白三烯等，這些脂質(zhì)不僅參與構(gòu)成外泌體，還參與細(xì)胞生理病理過(guò)程[6,12-13]。研究認(rèn)為，通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸與鄰近細(xì)胞通訊是外泌體的最主要作用，外泌體可通過(guò)分泌的可溶性因子(如激素、細(xì)胞因子)與遠(yuǎn)處細(xì)胞通訊，還可通過(guò)電子、化學(xué)信號(hào)(如核苷酸、脂質(zhì)和短肽)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；此外，外泌體對(duì)維持組織細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)均起到關(guān)鍵作用，并可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，從而介導(dǎo)免疫反應(yīng)[6-7]。

根據(jù)外泌體大小、形態(tài)、浮選密度和標(biāo)記蛋白的不同，外泌體的分離方法亦不同。外泌體常通過(guò)差速離心、尺寸排阻色譜、免疫親和捕獲、商用試劑盒或微流體技術(shù)從條件培養(yǎng)基或體液中分離獲得[6,13]。目前認(rèn)為超速離心法是純化外泌體的最佳方法，可獲得高純度外泌體。實(shí)驗(yàn)常用的商用試劑盒一般基于大小尺寸沉淀的方法，可大幅度縮短外泌體分離的操作時(shí)間，具有高效、可靠、可重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)；免疫親和捕獲產(chǎn)量很低，但特異性較高[6,11]。納米微流體是一種分離外泌體的新技術(shù)，具有分離速度快、純度高和回收率高的特點(diǎn)，應(yīng)用潛力巨大[14-15]。熒光細(xì)胞激活分選、電子顯微鏡、流式細(xì)胞儀、液相色譜質(zhì)譜以及Western印跡法是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)外泌體的常用方法。動(dòng)態(tài)光散射和納米粒子跟蹤分析技術(shù)具有快速、可靠、半定量的特點(diǎn)，但無(wú)法通過(guò)特定大小的顆粒識(shí)別外泌體的種類。利用表面等離子體共振與對(duì)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域外泌體膜蛋白的特異性抗體進(jìn)行微陣列分析的組合定量檢測(cè)和表征腫瘤來(lái)源的外泌體時(shí)，不需要富集或純化，為檢測(cè)、表征外泌體提供了簡(jiǎn)便有效的新方法[6,16-17]。目前分離和純化外泌體的方法仍存在許多缺點(diǎn)和不足，仍需進(jìn)一步的研究，以促進(jìn)其臨床應(yīng)用。

2 外泌體在肺纖維化中的作用

外泌體與多種纖維化疾病相關(guān)，包括腎纖維化[18]、心臟纖維化[19]、肝纖維化[20]等。攜帶特定物質(zhì)的外泌體不但參與了器官纖維化的發(fā)病機(jī)制，還可作為血液、尿液等體液的纖維化生物標(biāo)志物，為疾病診斷提供依據(jù)[18-20]。干預(yù)外泌體攜帶物質(zhì)以及使用干細(xì)胞衍生外泌體已成為治療纖維化疾病的新手段[21-22]。外泌體對(duì)肺纖維化的作用，取決于其中所含物質(zhì)的種類。

2.1外泌體中核酸在肺纖維化中的作用 目前，對(duì)外泌體中與肺纖維化相關(guān)核酸的研究主要集中于miRNA，含有miRNA的外泌體通過(guò)表面蛋白以配體-受體方式與細(xì)胞作用，根據(jù)外泌體所含miRNA種類的不同，對(duì)肺纖維化產(chǎn)生的影響不同[23]。Makiguchi等[24]對(duì)小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，急性炎癥期(第7天)和慢性纖維化期(第28天)模型小鼠血清EV miR-21-5p水平均升高；該研究進(jìn)一步監(jiān)測(cè)不同血清EV miR-21-5p水平IPF患者肺活量6個(gè)月并隨訪30個(gè)月發(fā)現(xiàn)，血清EV miR-21-5p水平較高IPF患者短期內(nèi)肺活量下降明顯，疾病進(jìn)展較快，長(zhǎng)期死亡率明顯高于miR-21-5p水平較低IPF患者，故認(rèn)為血清EV miR-21-5p可作為IPF疾病進(jìn)展和死亡預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。Liu等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，博來(lái)霉素誘導(dǎo)的纖維化小鼠以及IPF患者的肺組織miR-21水平上調(diào)，證實(shí)miR-21在肺纖維化中具有重要作用。劉理靜等[26]發(fā)現(xiàn)，miR-21通過(guò)抑制血小板反應(yīng)蛋白1型基因表達(dá)促進(jìn)1型膠原蛋白和3型膠原蛋白合成，進(jìn)而促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生。miR-21的外泌體參與并促進(jìn)了肺纖維化的發(fā)生，且血清miR-21水平可作為判斷IPF患者預(yù)后的指標(biāo)。

Njock等[27]通過(guò)檢測(cè)比較IPF患者與健康人群痰液中外泌體miRNA種類及含量的研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p、miR-33a-5p、let-7d-5p三種miRNA與IPF密切相關(guān)；通過(guò)對(duì)肺部一氧化碳擴(kuò)散能力/肺泡體積比的評(píng)估發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p表達(dá)與肺功能呈負(fù)相關(guān)，并可通過(guò)Wnt信號(hào)通路促進(jìn)間充質(zhì)祖細(xì)胞正常增殖，miR-142-3p水平升高可能導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞增殖和分化之間的平衡改變。另有研究報(bào)道，miR-142-3p過(guò)表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)加氧酶-2的表達(dá)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路保護(hù)博萊霉素誘導(dǎo)的MLE-12小鼠肺泡上皮細(xì)胞損傷，推測(cè)含miR-142-3p的外泌體可能具有減輕肺纖維化的作用[28]。而let-7d-5p與miR-142-3p的作用完全相反，let-7d-5p下調(diào)可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而參與IPF的病理生理過(guò)程[27]。另有報(bào)道稱，miR-33a可以通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑促進(jìn)肝纖維化的形成[29]。由此可見(jiàn)，痰液中攜帶miRNA的外泌體參與了IPF的發(fā)病機(jī)制，可作為IPF診斷的生物標(biāo)志物。Yao等[30]研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化大鼠模型miR-328的表達(dá)上調(diào)，且參與抗炎作用的M2型巨噬細(xì)胞分泌的含有miR-328的外泌體可靶向作用于FAM13A基因并下調(diào)其表達(dá)，刺激肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖。由此可見(jiàn)，肺纖維化患者或肺纖維化動(dòng)物模型外泌體的miRNA種類及含量均發(fā)生了變化，提示含有miRNA的外泌體參與并調(diào)控IPF疾病的發(fā)生。

2.2外泌體中蛋白質(zhì)在肺纖維化中的作用 外泌體中的蛋白質(zhì)包括跨膜蛋白和內(nèi)含蛋白，其中內(nèi)含蛋白在肺纖維化過(guò)程中起重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)外泌體的非經(jīng)典途徑分泌熱激蛋白70[31]。與野生型小鼠相比，熱激蛋白70過(guò)表達(dá)可改善轉(zhuǎn)基因小鼠博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺損傷和炎癥反應(yīng)，抑制肺纖維化和肺功能障礙，且轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平較低[32]。

Wnt信號(hào)通路是由配體Wnt蛋白和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是器官和組織發(fā)育的必需途徑，也是導(dǎo)致各種器官纖維化的主要原因之一[33]。Dziao等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠成纖維細(xì)胞可分泌含有Wnt3a和Wnt5a的外泌體，Wnt3a可特異性地激活成纖維細(xì)胞的Wnt/β聯(lián)蛋白途徑，與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β共同作用，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的促纖維化反應(yīng)。但含有Wnt5a外泌體不依賴β聯(lián)蛋白發(fā)揮作用，而是通過(guò)激活蛋白激酶1/2和激活子蛋白1的非經(jīng)典途徑，誘導(dǎo)促纖維化的白細(xì)胞介素-6的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，IPF急性發(fā)作患者白細(xì)胞介素-6水平顯著升高[35]。Marin-Medina等[36]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a在IPF患者和肺纖維化小鼠模型肺泡灌洗液EV中上調(diào)，而肺成纖維細(xì)胞是Wnt5a EV的主要來(lái)源。對(duì)原代肺成纖維細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，原代肺成纖維細(xì)胞衍生的EV或IPF支氣管肺泡灌洗液中的EV均可以通過(guò)內(nèi)含的Wnt5a誘導(dǎo)原代肺成纖維細(xì)胞的增殖，但不能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化[37]。

除蛋白質(zhì)外，外泌體還含有蛋白酶。蛋白酶/抗蛋白酶失衡是許多慢性肺病的標(biāo)志，其中蛋白酶靶向細(xì)胞外基質(zhì)組分以降解、破壞組織結(jié)構(gòu)，并釋放細(xì)胞外基質(zhì)衍生的生物活性信號(hào)，導(dǎo)致炎癥持續(xù)存在。Szul等[38]報(bào)道了一種調(diào)節(jié)人類肺部疾病中的慢性中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)至關(guān)重要的蛋白酶——脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶，脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶可裂解膠原片段并釋放一種重要的中性粒細(xì)胞趨化劑——三氨基酸序列脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸，可見(jiàn)脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶存在于人類氣道上皮細(xì)胞，由外泌體釋放并受模式識(shí)別受體Toll樣受體4的調(diào)節(jié)。另有研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞趨化因子脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸以及受香煙煙霧成分刺激乙?；母彼?甘氨酸-脯氨酸具有抗纖維化的作用，并分別在白三烯A4水解酶和血管緊張素的作用下降解，故含有脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶的外泌體可能減少肺纖維化的發(fā)生[39]。由此可見(jiàn)，外泌體中不同的內(nèi)含蛋白可通過(guò)不同途徑直接或間接促進(jìn)或抑制肺纖維化。

2.3外泌體中脂質(zhì)及其衍生物在肺纖維化中的作用 肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞分化為可收縮的肌成纖維細(xì)胞，并增殖和分泌過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)是肺纖維化發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，而某些脂質(zhì)信號(hào)分子(如前列腺素)可抑制肌成纖維細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β作用于原代人肺成纖維細(xì)胞可誘導(dǎo)環(huán)加氧酶-2表達(dá)，并產(chǎn)生含有前列腺素E2的EV，EV通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生而發(fā)揮抗肺纖維化作用；此外，以上源自肺成纖維細(xì)胞的EV還可通過(guò)自分泌與旁分泌作用傳遞抗纖維化信號(hào)，在一定程度上證實(shí)了活化的成纖維細(xì)胞對(duì)附近幼稚成纖維細(xì)胞存在顯著抗纖維化作用[40-41]。既往研究表明，花生四烯類代謝物白三烯是肺纖維化的重要調(diào)控因子，且IPF患者支氣管肺泡灌洗液和肺組織中白三烯B4水平升高[42-43]。Majumdar等[44]研究發(fā)現(xiàn)，在中性粒細(xì)胞趨化過(guò)程中，白三烯B4在細(xì)胞多囊泡中以外泌體方式分泌，可見(jiàn)含有白三烯B4外泌體與肺纖維化的形成密切相關(guān)。

3 干細(xì)胞源性外泌體對(duì)肺纖維化的作用

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于中胚層組織中的多能干細(xì)胞，可從骨髓、脂肪組織、血液、胎盤(pán)和臍帶等各種組織及器官中分離。Willis等[45]的研究表明，MSCs衍生的外泌體可改善肺形態(tài)和發(fā)育，減少肺的纖維化，改善肺血管重塑。Tan等[46]對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞衍生的外泌體與人肺成纖維細(xì)胞所衍生的外泌體進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，人羊膜上皮細(xì)胞衍生的外泌體富含更多的與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞發(fā)育生長(zhǎng)、促分裂原活化的蛋白激酶、炎癥、表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子相關(guān)通路的蛋白質(zhì)，可靶向磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路、促分裂原活化的蛋白激酶途徑、Ras蛋白途徑、Hippo蛋白激酶途徑、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、黏著斑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等纖維化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的miRNA，發(fā)揮抗炎、抗纖維化、促進(jìn)小鼠支氣管干細(xì)胞再生的作用。Fujita等[47]發(fā)現(xiàn)，MSCs衍生的EV通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激改善各種肺部炎性疾病所造成的肺組織重塑和纖維化。Shentu等[48]研究證明，MSCs衍生的EV通過(guò)胸腺細(xì)胞表面糖蛋白1與整聯(lián)蛋白β相互作用后促進(jìn)成纖維細(xì)胞對(duì)MSCs衍生的EV攝取，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞中α平滑肌激動(dòng)蛋白的表達(dá)，降低纖維粘連蛋白和膠原蛋白Ⅲ的表達(dá)，抑制肺成纖維化細(xì)胞向肌成細(xì)胞分化，從而減輕肺纖維化。將MSCs衍生的外泌體作為肺纖維化的治療方案是目前的研究熱點(diǎn)，但MSCs衍生外泌體發(fā)揮抗肺纖維化的機(jī)制尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步探索。

4 小 結(jié)

外泌體作為一種攜帶核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的功能性載體，在肺纖維化發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中起重要作用。攜帶某一特定物質(zhì)的外泌體可促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生，而攜帶另一些特定物質(zhì)的外泌體又能發(fā)揮抗肺纖維化的作用。外泌體的相關(guān)研究有助于解釋肺纖維化的發(fā)病機(jī)制以及調(diào)控肺纖維化的疾病進(jìn)展。目前，對(duì)外泌體的認(rèn)識(shí)十分有限，隨著研究的不斷深入，與肺纖維化相關(guān)的外泌體內(nèi)含物及作用機(jī)制將逐漸被揭示。未來(lái)外泌體將有望成為臨床診斷、治療肺纖維化的重要手段。